微生物学检测——菌落总数

时间:2023-10-01 20:19:00   热度:37.1℃   作者:网络

菌落总数又称需氧菌总数、嗜氧菌总数,在英文标准中的术语有Total plate count, Standard plate-count bacteria, Aerobic bacterial count,Colonies number等,是微生物学检测技术中应用最广泛的一种卫生学检测技术,亦是嗜温细菌和真菌的菌落总计数,其通过一定条件下如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等,每单位(如克、毫升等)检样所生长出来的微生物,在卫生学上可以表示被污染程度的标志。

常见操作方法

菌落计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(Most-Probable-Number Method,简称MPN法),其中平皿法可分为倾注平皿法和涂布平皿法,常见的菌落总数操作方法见表1。 

表1 常见菌落总数的操作方法汇总

测试标准

适用范围

操作方法

GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

食品

倾注平皿法/菌落总数测试片

FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》

食品

倾注平皿法/螺旋板法

GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》

饲料

倾注平皿法

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》

游泳池水

倾注平皿法

GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》

饮用水/水源水

倾注平皿法/酶底物法

WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》

环境

六级筛孔撞击式微生物采样器

GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》

一次性卫生用品

倾注平皿法

《化妆品安全技术规范》2015版

化妆品

倾注平皿法

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

化妆品

平皿法/膜过滤法

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

药品

平皿法/薄膜过滤法/MPN法

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》

根据上表的适用范围和操作方法可得出,平皿法是使用范围最广。

根据测试标准适用范围和样品特性:

A.平皿法因可操作性性强,会更多用于污染度高的被检样品;

B.薄膜过滤法适用于测试量需求大且污染度一般的液体样品;

C.MPN法可用于微生物计数时精确度较差时,包括对于某些微生物污染度很小的样品。

故在日常测试中,可根据样品的污染度情况去选择更合适的菌落总数测试操作方法。

样品的取样量与稀释液选择

样品的取样量与其质量标准或测试方法去选择,对于官方标准未明确取样量的,亦可根据结果的代表性加大取样量。稀释缓冲液的选择则是要求样品在稀释缓冲液中能够充分混合,从而保证样品的均一性,故不同样品,会有不同的稀释液需求。日常工作中,常见的稀释缓冲液与要求见表2。

表2 常见的稀释缓冲液信息汇总

测试标准

样品量

稀释液

备注

GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

25g/mL

无菌生理盐水/磷酸盐缓冲液

 

FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》

50g/mL

磷酸盐缓冲液/无菌水

 

GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》

25g/10g

0.85%生理盐水/磷酸盐缓冲液

 

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》

原液

无菌生理盐水

 

GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》

原液

无菌生理盐水

 

WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》

28.3L/min,(5-15)min

不适用

 

GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》

10±1g

无菌生理盐水(200mL)

不进行梯度稀释,做5平行

《化妆品安全技术规范》2015版

10g/mL

无菌生理盐水

无法充分溶解稀释液中的样品可加吐温80和/或石蜡

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

1:10(样品:加稀释液后)

无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等

 

最终的取样量与稀释液,需通过样品方法学适用性验证方能使用。

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP  9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》

常见培养条件

菌落总数的培养条件会因不同的样品类型或制定机构而有所差异,其差异包括培养基、培养温度和培养时间的选择。菌落总数常见的培养条件见表3。

表3 菌落总数的常见培养条件汇总

测试标准

培养基

培养温度

培养时间

GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

平板计数琼脂(PCA)

36±1℃(水产品30±1℃)

48±2h(水产品72±3h)

FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》

35±1℃(牛奶32±1℃)

48±2h

GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》

营养琼脂(NA)

30±1℃

72±3h

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》

36±1℃

48h

GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》

36±1℃

48±2h

WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》

35~37℃

48h

GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》

35±2℃

48h后

《化妆品安全技术规范》2015版

卵磷脂、吐温80-营养琼脂 (LTNA)

36±1℃

48±2h

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)

32.5±2.5oC

 

72±6h

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

3~5天

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》

结果观察与报告

菌落总数在进行计数时,肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(CFU/cfu,Colony Forming Units)进行报告。在计数时,首先需明确计数范围是否符合要求,从而保证测试结果的准确性和可靠性,不同的测试方法在首选计数范围会有一定差异,以及显色剂在观察中的应用也有一定的要求。详情见表4。

表4  结果观察与报告的一般要求

测试标准

培养基中是否可加显色剂1

首选计数范围

最终结果报告

GB4789.2-2022 

《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

30~300cfu

100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2,采用“四舍五入”。

FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》

25~250cfu

<25cfu则报告<25或实际值,>250cfu则报告>250或TNTC2

GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》

30~300cfu

100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》

30~300cfu

100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。

GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》

30~300cfu

100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。

WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》

报告cfu/m3

GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》

全部无生长报<4cfu/g(mL),若生长,报100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字。

《化妆品安全技术规范》2015版

30~300cfu

100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

平皿法:30~300cfu;薄膜过滤法:15~150cfu。

100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字。

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION

OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

平皿法:不超过250cfu;薄膜过滤法:记录结果。

取两位有效数字报告

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》

平皿法:不超过300cfu;薄膜过滤法:不超过100cfu

取两位有效数字报告

注:

1. 显色剂一般为TTC,TTC全称为0.5%氯化三苯四氮唑。加此显示剂后,多数菌落显示红色。

2. TNTC全称为多不可数,即Too Number To Count。

菌落总数的测定,不同样品有不同的特性,故在进行此方面卫生学测试时,结合行业需求,以及样品的生产工艺、消费对象、使用方式等需求,选择合适的测试操作流程,同时保证在报告结果时,亦需根据市场所选用的方法进行报告结果。

综合以上,卫生学的菌落测试在实验操作中虽然有差异,但总体的差异性不大,比如培养基都是非选择性生长培养基,培养温度基本在35℃左右,培养时间则温度越高,时间则可减少。故保证菌落总数测试结果的准确性与可靠性时,根据实际需求,通过调节测试方法的取样、稀释液、培养条件等来建立更符合本实验室的菌落总数测试方法。

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