药品质量的有效控制，离不开科学可靠的评估方法。开发一系列稳健可靠、简便快捷的分析方法，已成为药物分析领域关注的热点，也是占领学科发展前沿的重要指标。为了确保分析方法科学有效，各国药典和质量控制技术指南很早就开始建立方法验证的指南。

       从对国际标准组织（I SO）I SO9000文件溯源来看，“验证”的概念约在1986年被提出。之后，I SO对该文件进行了五次改版，但对“验证”一词的定义基本一致，即“通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定”。

       1987年，美国食品药品管理局（FDA）首次正式提出对分析方法应该进行验证的要求。随后，各国技术指南文件先后引入方法验证的定义，推动方法验证的科学化、规范化发展。经过近30年的努力，各国药监部门对方法验证具体的实施和参数要求越来越严谨和科学。

       各国制定技术指南

       FDA：历经三次演变

       现行版FDA关于方法验证的指南共经历了三个版本的历史演变。

       2010年以前，FDA指南对于方法验证的相关规定主要是关注方法的分类和主要的方法验证性能参数，即准确度、精密度（重复性和中间精密度/再现性精密度）、线性、范围、检测下限（LOD）和定量下限（LOQ），对方法评价的指标计算问题没有提出深入的要求。

       2015年，结合新引入的科学理论和实践中遇到的问题，FDA指南对方法验证进行了全面改版，主要明确了以下内容：

       第一，明确了指南的适用范围，即适用于原料药、制剂、杂质或生物液体中的化合物等理化分析方法的验证，不适用于生物和免疫学方法的验证。第二，引入了方法生命周期的管理理念，方法评估涵盖方法开发（devel opment）、验证（val i dat ion）、确认（ver i f i cat ion）和转移（t r ansf er）等内容；在产品生命周期中遇到生产工艺变化时，要基于风险分析考虑现有方法的验证需求。第三，引入质量源于设计（QbD）理念，提出了方法验证的规范设计要求，即方法评估应在方法早期的耐用性研究中采用系统设计方式（如方法参数的实验设计）,开展多变量实验设计等。第四，提出评估方法特性（如准确度、精密度等）时需考虑其用途，如从生产工艺的中间产品至成品，不同样品的要求不同。第五，提出统计规范化要求，如对方法验证更多性能参数的统计计算、统计分析的前提条件和计算注意事项以及选用统计模型和选择统计分析软件的注意事项提出要求。第六，其他更广泛的要求，如方法替代的比较要求、方法验证报告的要求等。

       基于方法生命周期管理理念，现行版FDA指南对方法在整个生命周期中应该进行的各项评估内容进行了概括性归纳，为方法验证提供了一个全新系统性的规范参考。但该指南对方法验证性能参数的具体计算规范未提出明确要求，对使用者而言还存在诸多不便。

       USP：确立统计分析指导原则

       1990年，美国药典（USP）22正式收载“方法验证”纲领性指导文件<1225>。该文件最初仅列出了三类分析方法的方法验证：用于检测主成分（包括防腐剂）的Ⅰ类方法、用于检测杂质或降解产物的Ⅱ类方法［包括定量（Ⅱa）类和限度（Ⅱb）类方法］以及用于溶出度/释放度等性能评价的Ⅲ类方法。2000年，USP24版在该指导文件中修改增加了鉴别（Ⅳ）类方法，为2005年的ICHQ2（R1）第1版奠定了坚实的基础。

       此外，从1990年至今，USP对方法验证的概念不断完善，分别于2007年相继提出了方法确认的概念及相关原则，于2012年提出了方法转移的相关概念和指导原则。然而，这些文件的补充仍然无法完全解答科研工作者的困惑。

       为使方法验证工作更完善和科学，美国药典委员会在2010年专门成立了关于方法验证的研究课题组。该课题组从实际应用中存在的问题出发，结合QbD理念和统计理论，对方法验证的性能参数进行全面系统的研究。经过近8年的努力，历经多个文件和版本的反复推敲，终于在2018年的USP41-NF36中，确立并正式收载了关于方法验证中对性能参数进行科学评价的第一个统计分析指导原则，即<1210>St at istical Tool s f or Pr ocedur e Val idation。该指导原则具有以下特点：

       第一，对于定量类分析方法，包括主成分含量测定（Ⅰ）类方法和杂质定量测定（Ⅱa）类方法，采用方法变异度方式，即方法的准确度-精密度联合评价的方式进行评价，提出了评价方法满足预期用途的新参数，即方法变异的容忍区间和预测区间。第二，否定了原来提出的使用Horwitz方程作为方法满足要求的判断依据。第三，明确了计算LOD使用回归线95%预测区间的方法；阐述了LOQ与新给出的检测限间的相互关系，并强调给出线性回归的决定系数和回归线标准误。第四，删除了很多原有的理论论述，如模型评价、不同实验设计的效能等。第五，给出了具体操作实例，以便于使用者理解。

      但该文件依然存在没有对专属性给出相关评价信息、不包含对溶出度/释放度的Ⅲ类方法验证评价的内容等问题。

      OMCL：从官方实验室角度切入

      欧洲官方实验室（OMCL）也非常重视分析方法验证。从2000年起，专门制定并起草了相关文件研究方法验证。对比OMCL的文件与美国FDA和USP的文件，笔者发现其内容有很大区别。美国FDA关于方法验证的指导性文件主要针对企业；USP主要从方法学角度对方法验证进行更为详细的说明；OMCL则从官方实验室的角度入手，开展方法验证的相关研究。

      在起草方法验证文件时，OMCL首先将检测方法从不同使用阶段需要提供的方法验证性能参数入手提出相应要求，如关于方法转移，提出了对药典（技术指南）方法的转移、生产商方法的转移、非法定发布方法的转移等验证的要求。对于新的分析方法，也提出了与国际人用药品注册技术协调会（ICH）所收载文件的相似要求。其次，为了更好地对方法进行评价，OMCL对方法是否满足预期用途的标准也进行了相应探讨，并从不确定度的角度出发，提出了相应的标准。

     然而，该指南文件将检测时所有的不确定度全部归为方法的精密度，本身就存在缺陷。若仅从方法能力指数的角度分析，文件所提供的判定标准也是对方法满足预期用途的最低要求。

      ICH：将进行全新修订

      ICH从1993年就提议协调方法验证的技术要求。1994~1996年制定完成现行版ICHQ2（R1）的雏形（Q2A和Q2B）。经过2005年的最终协调，形成现行版ICHQ2（R1）。

      现行版ICHQ2（R1）仅将分析方法分为三类，即鉴别类、有关物质检测类和分析类，其中将溶出度测定类方法归于分析类中，但USP将其作为单独一类方法。该文件自2005年制定以来，一直没有将新研究进展吸收于其中。随着近10年来技术的发展和进步，该文件已经无法回答实施中遇到的具体问题。正是意识到这一点，ICH在2018年6月22日的Press Rel ease中宣布，将对该文件进行全新修订。

     《中国药典》标准：有待进一步完善

     《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）自2000年开始收载方法验证的指导原则。该指导原则一直使用“验证”一词表达“val idat ion”，内容以ICH文件为基础，也将验证方法的类型归为三类，将溶出度/释放度实验与含量测定实验归为Ⅰ类。2005年版和2010年版内容未作改动，在2015年版修订时增加了判断方法满足预期用途的标准。然而，该标准采用Hor wit z方程，该方程目前在国际上已被否认，且USP也放弃使用该标准。

       由于理化分析方法应用广泛，我国也对该类方法制定了相应的国家标准。但在该标准中，将“val idat ion”一词翻译为“确认”，而不是“验证”。

       这种对重要专业术语的不同翻译，给科研工作者带来了不便和困惑。此外，国内对方法验证进行系统的方法学研究起步较晚，相关研究成果和报道较少。

       逐步发展 日渐科学

       分析方法验证技术指南的发展历程大致可分为三个阶段。第一阶段：20世纪80年代后期至90年代末期。在该时期，药品领域的专家开始重视方法验证的重要性，并着手起草、规范方法验证的指导原则或技术指南。其中以USP在1990年正式收载该指导原则为标志。第二阶段：1990~2010年。各国的药品领域专家对理化分析方法技术指南中的不同之处进行协调统一并开始实践应用。此时的一个重要标志是形成具有广泛影响力的ICHQ2（R1），其主要关注点是提供哪些方法验证基本参数问题。第三阶段：2010年至今。经过了第二阶段的推广实施，加上一些新理念的引入（QbD和方法生命周期管理），药品领域专家对方法验证中的一些基本问题深入反思，并协同统计学专家进行跨学科研究和评估。

       目前，药品领域的方法学研究专家主要解决三个问题：第一，判断一个方法是否满足预期用途的标准及其科学性；第二，哪些参数能更直接提示该方法可满足预期用途；第三，如何获得可靠的方法验证参数。

       问题突出 有待商榷

       USP<1210>及存在问题

       USP在最新收载的<1210>中，对方法验证中的上述三个基本问题提出了自己的规范：第一，判断一个方法是否满足预期用途，更可行方式（相比于Hor wi t z方程）是使用方法变异的容忍区间和预测区间。第二，为更好地判断准确度、精密度、检测下限和线性的变异，需提供下列变异性描述性指标——准确度的置信区间、精密度的置信上限和线性的残差分布，对检测下限的确定采用回归线95%预测区间。第三，要获得可靠的性能参数，需要进行全面的风险分析和科学的实验设计（析因或嵌套）。然而，这些方式是否能满足方法验证的需要，还需要进行更广泛的探索。

       《中国药典》中方法验证的指导原则值得商榷的内容

         第一，《中国药典》从第一次收载该指导原则起，一直将“met hod val idation”表达为“方法验证”，而国内其他领域，甚至包括医疗器械的技术指南或指导原则，都表达为“方法确认”；国家标准也将“val i dat i on”翻译为“确认”；也有文章专门探讨val i dat i on和veri f i cat i on 两个专业术语的翻译问题。笔者认为，关键术语的混乱问题应该尽早解决，以免造成研究和应用时的混乱。

        第二，目前《中国药典》四部（2015年版）中有两个关于方法验证的指导原则，即<9012>和<9101>，其本质均是对理化分析方法的验证，只是检测的样品不同，前者为生物样品，后者强调的是化学药品。作为国家统一的药品法典，建议国家药典委员会借鉴FDA文件，对这两个指导原则进行有机整合，形成统一标准。

        第三，方法验证是对检测方法的方法学研究，需要跨学科综合，尤其是统计学方法的引入，将更好地促进药品分析方法学的开发。