在整个生产过程中，应通过基于风险的方法对关键和非关键质量属性（如适用）建立过程中监测和/或控制测试（可接受的限制），以便从生产开始到结束对每个批次/批号的质量进行监测。作为IND或BLA批准的一部分，放行规范和表征方法应与监管部门达成一致。

用于临床试验的mRNA疫苗应在适合临床发展阶段的GMP条件下制备——即，开发初始或早期阶段，生产和控制程序仍在开发中，尚未得到验证，可能无法完全遵守法规。临床试验材料应在满足适当质量控制标准的基础上放行。在紧急情况下，根据效益-风险评估，可以考虑使用未完全按照GMP制备的起始材料。需要确保生产和控制中使用的所有材料的质量和正确标识。应特别注意动物（包括人类）衍生成分的来源。还应注意确保避免或控制有相关证据和风险评估支持的潜在外来因素。生物制品质量控制的许多通用要求，如内毒素、稳定性和无菌测试，也适用于mRNA疫苗。

随着产品开发推进，监管机构要求的详细程度会增加。在临床开发的初始阶段，IND中包含的信息应足以评估药品和生产过程中产生的风险。例如，这将包括工艺中使用的所有材料的鉴别和规范，生物来源材料风险评估，生产设施的GMP合规性认证或阶段性认证，工艺和测试的简要说明，拟用于临床试验的疫苗批次测试结果和初步稳定性测试结果。与所有疫苗一样，对于关键的临床试验，关于mRNA疫苗质量（生产和控制）的详细程度预计将大幅提高。关键临床试验和商业生产中使用的材料应完全符合GMP。

在临床开发过程中进行的任何生产变更，尤其是在关键安全性和有效性试验完成后在BLA前进行的生产变更，都需要进行描述和证明，与临床批次进行对比分析，提供对产品成分（例如，mRNA序列变化、效价增强、辅料变化或防腐剂添加）或生产（例如，工艺、地点或规模的变化）所做的任何更改的详细信息。根据最终产品成分的改变方式（例如，添加新辅料），可能需要进行新的非临床研究。对于生产工艺的变更（如放大或净化工艺的变更），应评估与使用先前工艺生产的原液和药品的可比性。此类可比性研究可能基于动物模型的免疫原性数据、理化分析结果、工艺和产品相关杂质研究和/或稳定性数据。

用于BLA批准的原液和药品放行规范和特征描述方法应涵盖关键属性，以确保提供安全有效疫苗所需的质量一致性，包括评估含量、特性、纯度、效力、质量和安全属性以及稳定性的方法。商业规范应根据在临床研究中已证明具有可接受性能的批次的试验结果进行定义。应说明LNP中配制的mRNA或sa mRNA疫苗的额外控制措施，包括原材料和辅料的控制措施，以及生产中间体的过程中控制措施。

mRNA疫苗的制造和控制

除了去除DNA模板、未连接的5’帽、未结合的核苷酸和酶（如RNA聚合酶），还应在可行范围内去除所有工艺相关和产品相关的杂质（例如，dsRNA和大小不正确的mRNA分子）。还应注意去除可能参与DNA模板生成的酶，如DNA聚合酶和限制性内切酶。纯化方法及其目的应予以描述和证明。任何纯化过程——如用蛋白酶消化蛋白质作为杂质减少步骤——都应在适当的开发阶段进行验证。

提供生产流程图，说明每个工艺步骤、在该工艺步骤中采集的样本以及采集样本的过程中控制试验。工艺流程图应阐明生产过程中达到原液、最终配方散装mRNA疫苗和最终填充mRNA疫苗（药品）阶段的步骤，以及流程图中取样进行过程控制和放行试验的步骤。还应说明在每个步骤中进行的测试。浓缩纯化mRNA（原液）或任何中间体（如最终配方散装mRNA疫苗）的保存时间应有稳定性研究支持。

提供有关配方和制造工艺优化的产品开发数据。例如，应考虑不同脂质的浓度、mRNA-脂质比率、缓冲液/溶剂的pH值、mRNA包封效率、脂质和mRNA的流速和混合速率，以及不同成分的解冻温度，因为这些都会影响药品质量。通过这种方式，可以仔细控制mRNA封装到LNP中的过程，并对生产方法和控制措施进行充分描述和适当验证。

对于自扩增mRNA（sa-mRNA），生产过程所需的控制措施可能与mRNA的控制措施相同或相似。但如果sa-mRNA编码复制子的mRNA和表达靶抗原的mRNA在不同分子上，将这两种RNA共同封装以使它们在体内被同一细胞吸收是很重要的，需要确保所需的mRNA充分封装在相同的LNP中，提供并证明两种包封mRNA的摩尔比，说明验证方法。如果这两种RNA分别被封装，然后混合，就需要证明这种方法的合理性。

关键质量控制点应包括：

a、起始材料、原料和辅料——包括但不限于：a）线性DNA模板；b）核苷酸；c）酶（例如，DNA依赖性RNA聚合酶（通常是T7 RNA聚合酶）、加帽酶、2’O-甲基转移酶、poly(A)聚合酶、DNA酶和蛋白酶K）；d）缓冲液；e）溶剂；f）柱树脂（柱层析用于纯化）和/或g）脂质。线性DNA模板被认为是制造药物的起始材料。其他列出的物品（以及任何未列出但也用于制造的物品）将被视为原料。辅料是指在最终药品中作为非活性成分存在的原材料。

• 任何动物源性（包括人源性）原料或辅料，应通过适当的采购、控制测试和风险评估进行控制，并符合WHO guidelines on transmissible spongiform encephalopathies in relation to biological and pharmaceutical products 与生物制剂和药品有关的传染性海绵状脑病指南。

• 避免或控制潜在的外来因素，通过相关证据和风险评估支持。

b、生产过程和中间体的过程控制——包括用于制造散装mRNA（原液）的过程，以及配方（LNP制造和封装步骤）、散装最终配方和最终配方填充过程；还包括LNP配方一致性的控制或验证、mRNA包封的一致性，以及部分mRNA和dsRNA杂质的去除。

c、mRNA原液和最终产品的放行。

d、工艺验证——证明商业化最终产品的生产一致性，并满足所需的质量标准

下表所示方法可被视为各种关键质量控制点表征或控制的可能方法示例（按潜在用途）。

疫苗结构和组成的一般信息和说明

提供描述mRNA原液和疫苗产品信息，包括设计、序列和结构、成分（例如脂质和其他辅料）以及每种辅料用量。还应提供所选辅料的原理和功能。在相关情况下，应包括有关所用脂质的结构和分子量以及它们在疫苗配方中作用的信息。

mRNA序列和元件排列

a、提供DNA模板序列。mRNA上所有元件的序列和位置或长度，包括起始密码子、终止密码子、侧翼UTR、调节元件（例如，RNA聚合酶启动子）和5’帽和3’poly(A)尾，以及靶抗原的开放阅读框（ORF）。如果编码了额外的蛋白质（如用于自扩增结构或细胞因子），则应提供其序列。描述结构中包含的任何附加序列的存在和功能。

b、由于疫苗mRNA可以含有天然存在、修饰或合成的核苷，因此序列信息应包括所使用的特定核苷。

c、此外，如果为了优化密码子而改变了天然序列，这些改变应该被描述和证明。密码子的改变可能有多种原因，包括更好地匹配人类细胞中适当tRNA的频率，获得特定的二级或三级mRNA结构，减少先天免疫反应或增加mRNA的体内稳定性。

d、如上所述，除了编码靶抗原外，sa mRNA还编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合物（复制子），应提供此类复制子序列，并解释其功能。通常，复制子和靶抗原存在于同一分子上，应说明和叙述每个成分的制造和控制。如果复制子与靶抗原位于不同的mRNA分子，则可能需要额外的控制，并应予以说明。

e、如果mRNA疫苗包含编码其他免疫调节剂（如细胞因子）序列或旨在充当免疫调节的非编码序列，应提供此类序列及其用途信息。

配方和成分

a、配方：提供用于商业生产的配方，列出单剂mRNA疫苗中每种成分的含量，确定每批总体积。如果药品中包含一个以上的mRNA分子，应予以说明，包括不同的mRNA分子是同时封装在单个LNP中，还是单独封装，随后混合。

b、化学性质和配方：mRNA的配方主要用于提高体内稳定性和帮助细胞摄取。虽然存在几种潜在的递送剂（如鱼精蛋白复合物、阳离子脂质体和基于脂质、聚合物或脂质/聚合物的纳米粒），但目前上市的mRNA疫苗封装在LNP中。这些配方的化学特性和结构配方（如纳米颗粒）的物理特性都是必需的，并且应该解决配方和最终产品的一致性和稳定性等特性。还应考虑脂质的质量和药品的关键质量属性。应提供mRNA-LNP及其摄取到靶细胞的充分特征。这可能包括了解生成的mRNA-LNP的表面化学、大小、多分散性、形状、电荷和蛋白结合特性，以确保实现对mRNA的充分保护和疫苗所需的稳定性。如果显示LNP具有固有的免疫调节作用，则应提供关于潜在优缺点的相关数据。因此，应描述可能影响疫苗安全性、免疫原性和有效性的配方特征，并在配方开发过程中考虑其效果（正向或负向）。

c、其他免疫调节剂或佐剂：mRNA也可能编码特定的免疫调节分子，如细胞因子。此外，单独佐剂或免疫调节（刺激或抑制）化合物可添加到配方中，或者，作为LNP的一部分。应提供此类添加剂对疫苗免疫原性贡献的证明。

d、额外的肽/蛋白质：如果包含额外的肽/蛋白质以使mRNA靶向抗原呈递细胞或其他特定细胞类型，或增加mRNA从内体释放，则需描述这些成分的序列和功能，并提供证据以支持其拟议的作用机制。

e、额外的辅料（如防腐剂）：应说明此类额外的辅料的成分、必要性和防腐效果（如为防腐剂），并证明不会对LNP性能产生不利影响。

起始材料、原材料和辅料的质量控制

关注生产中使用的所有材料的来源和质量。原材料应从批准的供应商处采购。按适当的材料供应商资格认证计划进行管理。为所有原材料提供符合性证书（CoC，如适用）和分析证书（CoA）。起始材料应按照要求和规范放行，以便在随后的GMP生产中使用。

说明起始材料、原材料和辅料，包括用于产生mRNA的材料（如DNA模板、核苷酸、酶、缓冲液、溶剂、任何纯化柱等）和LNP中的脂质。提供有关其来源、质量、控制、稳定性和作用的信息，包括每种材料用于生产工艺的节点。材料应适用于GMP生产，并应提供国际公认药典的参考资料或的详细的规范信息。

生产LNP所使用的脂质来源和质量（尤其是LNP中以前未进行过非临床或临床研究的新型脂质）信息应足够详细，以便对其安全性和质量进行有意义的评估。提供新型脂质的生产工艺和控制细节。如果相关，应考虑对（阳离子）脂质进行亚硝胺风险评估。

应提供制造地点和制造过程的详细信息，以及所需的过程控制和起始材料、原材料、中间体和最终辅料的规范。考虑溶剂的使用和控制，以及元素杂质污染的可能性。辅料相关的杂质水平也应得到适当控制和证明。详细说明任何净化和隔离步骤。为确保拟用的新型辅料的质量，其制造商应提供用于材料表征、稳定性监测和批分析方法的相关信息。由于聚乙二醇化脂质的加入在提供体内稳定性和增强LNP的细胞相互作用方面起着关键作用，因此应对聚乙二醇化脂质进行适当的控制（例如，分子量、多分散性和摩尔百分比）。

以质粒为起始材料的线性DNA质量

线性DNA模板被认为是mRNA疫苗GMP生产的起始材料。如果线性DNA是由质粒DNA制备的，那么建立细胞库的程序和质粒DNA的制造应按照用于后续GMP制造的材料生产要求进行。

需建立、描述并测试细胞库系统的微生物纯度（无细菌和真菌污染）和特性。必须证明种子库的遗传稳定性。如果poly（A）尾编码在质粒DNA中，那么应该特别测试DNA质粒上的该区域的重组率。纯化过程也需要到位，以减少DNA质粒中的杂质（如RNA、宿主细胞DNA、蛋白质、脂质和多糖）。生产过程的设置应尽可能降低微生物污染的风险。

DNA质粒和线性DNA模板测试包括遗传鉴定（测序）、完整性（包括确认所需的编码抗原序列和调节/控制序列）和线性DNA百分比，以及残余基因组DNA、RNA和蛋白质的测试（使用适当的参考标准），无菌或允许的生物负荷，以及内毒素水平。在早期开发中，检测可能只在DNA质粒或线性DNA上进行。

在早期临床开发中，使用质量良好的材料是可以接受的，因为预计将有更多控制来支持关键试验和商业制造。

原辅料放行

为所有原材料提供符合性证书（CoC，如适用）和分析证书（CoA），并明确说明哪些测试由mRNA制造商进行，或根据原材料制造商/厂商/供应商提供的CoA接受材料。起始材料应按照要求和规范放行，以便在随后的GMP生产中使用。

工艺开发和中间过程控制

应提供商业生产过程的开发历史。制定并证明生产过程关键步骤报警和处置限制的测试和验收标准，以确保过程控制并提供反馈。在使用成熟平台技术的情况下，可考虑从已批准产品生产中获得的知识。

生产工艺验证应证明其符合其关键参数，并生产出一致的、符合预定义质量属性的产品，包括证明工艺和产品相关杂质的重复性和一致性，达到预期人用可接受的水平。

初步临床试验中使用的候选疫苗通常不需要工艺验证，但在临床材料的制造过程中，应验证或适当证明关键步骤，如无菌加工和药品无菌。

产品特性

除了过程中和批量放行试验外，还应提供mRNA（原液）和最终产品的特征总结。使用一系列正交的化学、分子、物理和生物方法进行严格表征至关重要。相比于每个批次都要开展的过程中和批次放行测试，表征研究和分析可以获得有关产品结构、性能和安全性的重要知识，以指导工艺和分析测试的开发和改进，但不需要对每批产品都进行。考虑选择用于确定各种属性的分析方法的理由，尤其是可能使用替代技术获得不同结果时——例如，使用不同方法进行粒度测量。因此，建议采用正交法。

确定生产的mRNA序列和正确序列的一致性程度。加帽和聚腺苷酸化过程的一致性程度也应进行表征，可能需要进行验证。应提供表达完整编码蛋白的证明。特别是，如果在表征研究期间证明目标抗原的截短或替代形式的表达，且这些替代形式将导致新抗原或不想要的免疫反应，那么可能需要重新设计mRNA序列。LNP中mRNA包封的一致性程度也应在表征过程中予以说明。颗粒摄取研究可以通过识别吸收颗粒的细胞类型、摄取模式或机制以及摄取效率来帮助描述潜在的效力测试，从而指导选择最适合评估这些活性的非细胞或体外方法类型。在表征过程中，应确定这些特征是否应作为关键质量属性和/或稳定性指示属性进行控制。

表征LNP的特定方面应该非常仔细，包括通过不同分析技术确定的颗粒大小，以探索含有mRNA的LNP的形态和尺寸特征。LNP中聚乙二醇（PEG）的密度和分布信息也有助于了解mRNA-LNP的表面性质。表面电荷的测量（例如，zeta电位）应被视为表征LNP的一种方法。这些特性将影响产品的体内稳定性、细胞相互作用和免疫反应特性，也将有助于疫苗生产的一致性。

mRNA编码的靶抗原引发的免疫原性属于关键特征，应在非临床研究中作为了解产品的一种手段进行表征。如果LNP具有固有的免疫调节作用，也应确定其特征。当mRNA中包含其他免疫调节元件或基因时，也应在非临床研究中确定其对mRNA编码的靶抗原的作用模式（例如，免疫原性）的贡献，以证明其包含在特征化产品设计中的合理性。考虑这些方面对于理解和了解产品非常重要，以便优化设计和开发适当的控制方法。

描述和研究起始材料可能引入的潜在杂质，以及纯化mRNA中的潜在产品或过程相关杂质。这些杂质可能包括残余细菌宿主细胞蛋白质（如用于制造DNA模板）、内毒素、残余细菌宿主细胞RNA和染色体DNA（如使用细菌生产）、酶（如DNA和RNA聚合酶和限制性内切酶）、未结合的核苷酸、双链RNA、不完整或大小不同的RNA，以及制造过程中使用的其他材料。提供纯化mRNA中存在的杂质的数据，以证明其最高可接受或最低可实现水平的规范设置合理。对于已知或潜在毒性作用的杂质和残留物，预计将进行毒理学风险评估。降解的mRNA可作为分析的一部分进行评估，如聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱（HPLC）和/或毛细管凝胶电泳。mRNA序列和结构的一致性程度，以及在体外转染细胞时其一致蛋白的表达，是药物产品需要确定的重要特征。

药物制剂中使用的脂质可能产生的任何潜在杂质（工艺和产品相关）也应进行表征和调查。这将允许对建议的规范限值进行调整，以便适当控制这些杂质，并将其控制在临床确定的可接受范围内。

生产一致性

与其他生物制品一样，在BLA前，应使用经验证的方法对多个连续批次进行测试和分析，以确定生产一致性。注意并调查一批与另一批之间在测试属性可接受范围之外的任何差异，结合产品和工艺知识以及对特定属性变化的关键性的评估，应作为所选规范的依据。

在早期临床开发期间，将进行少量生产，生产一致性的证明有限或不可能。随着在产品开发过程中获得生产经验，证明一致性的能力将增加。批次一致性的确认通常在提交BLA前的开发晚期（例如，扩大到商业制造时）进行。无论何时变更生产工艺，都应证明批次间的可比性，尤其是与关键研究中使用的批次和预期商业化生产工艺中使用的批次的可比性。