导读

急性髓细胞白血病（AML）是一种异质性血液系统恶性肿瘤，以不成熟髓母细胞的，异常克隆扩增为主要特征，其进展快速、预后较差。尽管大多数AML患者对治疗有初步反应，但复发仍然是当前彻底治愈该疾病的根本挑战。MRD指治疗后仍存在于患者体内的癌细胞群，无法通过传统的形态学评估检测到，是AML及其他恶性肿瘤复发的关键储库。因此，准确识别相关MRD克隆有助于对患者进行风险分层并指导进一步治疗以预防复发。

近年来，NGS已成为一种颇具前景的技术，极大扩展了MRD监测技术的应用范围，但传统NGS的MRD检测灵敏度仍有待提高。此外，由于AML的克隆复杂性，传统分析方法在理论和经验上都面临障碍。因此，目前亟需一种敏感、特异的MRD检测方法为临床干预提供有效信息。

单细胞DNA（scDNA）测序技术最近被用于研究AML的克隆结构，以区分克隆造血（CH）、白血病前克隆（preleukemic）和白血病克隆等。基于这些前期研究，近日，美国纪念斯隆凯特琳癌症中心的研究团队在Science Advances发表了题为“Single-cell genotypic and phenotypic analysis of measurable residual disease in acute myeloid leukemia”的文章。研究团队开发了一种新型单细胞MRD（scMRD）检测方法，将靶向前体/母细胞群的流式细胞术检测与scDNA测序和免疫表型相结合，其灵敏度较高并能解析克隆结构，提供克隆特异性免疫表型数据。scMRD检测增强了MRD检测灵敏性，同时阐明了在AML治疗中存活的CH/preleukemic 和白血病细胞的克隆结构。

文章发表在Science Advances

主要研究内容

scMRD突变检测的评估

研究团队将前体/母细胞富集（FACS）技术与scDNA+蛋白质测序技术相结合，开发了scMRD检测方法，并定制了一个包含109个扩增子的scDNA panel，共涵盖31个已知与恶性血液病相关基因。为提高检测通量并降低成本，研究团队将来自不同患者的样本多路复用到每个整合的scDNA+蛋白运行中，并开发了一种基于单核苷酸多态性（SNP）的计算算法，对多路运行结果进行反卷积计算，最终用于单样本和整合分析。

为评估scMRD检测的敏感性，研究团队进行了一项限制性稀释研究。结果显示，在极限稀释阈值0.1%的情况下，在所有11个重复中发现了预期的病理突变；阈值为0.01%和0.005%时，分别8个重复（共10个）和1个重复（共3个）中检测到突变；空白对照中未发现突变。上述数据表明scMRD检测突变的灵敏度较高。

图1. scMRD突变检测的评估。来源：Science Advances

scMRD检测在AML患者样本中的应用

接下来，研究团队对30份诱导化疗后冷冻保存的MRD样本进行scMRD检测，样本共来自29名AML患者，其中7个样本在异基因造血干细胞移植（alloHSCT）后获得。该研究纳入的每个患者/样本，在进行诊断和MRD检测时的白血病母细胞免疫表型均为CD34+或CD117+。

结果显示，在76.7%的样本和57.9%的突变中，批量NGS和scMRD检测到的MRD状态和突变检测结果一致；与批量NGS相比，通过scMRD检测到的突变的变异等位基因频率（VAF）显著更高。此外，在scMRD和批量NGS panel检测的33个不一致突变中，scMRD发现了17个被批量NGS遗漏的突变，包括RUNX1、NPM1、KRAS、IDH2、WT1、NRAS、JAK2、TP53和SRSF2突变，其中多数与复发相关。

图2. scMRD运行的反卷积计算。来源：Science Advances

克隆结构和克隆特异性免疫表型的解析

研究团队评估了scMRD根据克隆结构区分MRD的能力，包括区分白血病克隆和携带CH/preleukemic的单突变克隆。结果显示，在复用样本中，scMRD能够准确解卷积CH/preleukemic和白血病的克隆结构。在MRD5-S3样本中，批量NGS在缓解时间点检测到DNMT3A p.R882H、DNMT3A p.R736C和TET2 p.Q654Kfs（scMRD panel未涵盖）突变；而scMRD在不同克隆中检测到两种DNMT3A突变：DNMT3A p.R882H/NPM1 p.W288Cfs突变、JAK2 p.V617F突变，其均在复发时间点被批量NGS检测到。

上述数据表明，相较批量NGS，scMRD能够解析出残留的白血病前克隆（即DNMT3A克隆）、旁观者克隆（即JAK2克隆）和复发时持续存在的白血病克隆（同源DNMT3A/NPM1）。

图3. MRD5-S3样本的克隆分析。来源：Science Advances

alloHSCT样本中供体和宿主细胞来源的鉴定

在研究队列中，接受alloHSCT的7个样本（来自6名患者）代表了供体和受体细胞的混合。研究团队基于种系SNP的反卷积识别出与供体来源一致的不同的非突变群，并通过匹配的移植前样本SNP图谱，将其确认为供体样本。所有7个样本的供体-宿主均成功配对。

在4例复发患者中，scMRD检测到的宿主细胞水平高于短串联重复检测，表明宿主细胞在未成熟区（immature compartment）中富集，这是复发的早期指标；供体、宿主细胞之间的细胞表面蛋白表达不同。样本MRD1-S4的分析结果显示，供体和NPM1突变体的宿主细胞明显分离，前者含有CD3+CD8+ T细胞亚群，后者显示CD33表达异常增加。

此外，T细胞激活标志物CD69的表达不仅在供体和宿主T细胞中被观察到，也在宿主白血病细胞中被观察到，表明其可能是MRD检测的表面标志物。通过scMRD可检测宿主白血病干细胞中的异常免疫表型，其与MFC检测结果一致。

图4. scDNA、蛋白联合分析可以同时鉴定供体细胞和MRD。来源：Science Advances

结 语

综上所述，该研究表明scMRD检测不仅能够敏感地进行MRD检测，还能解析克隆结构，并有可能区分具有多个共同发生突变的单突变CH/preleukemic和白血病克隆，有助于临床决策至关。该方法的未来应用还需寻求进一步优化计算解复用，以最大限度地提高细胞分类率，同时最大限度地减少错误分类。总之，该研究为描述高危MRD克隆的遗传和表型特性以及更好地理解AML中MRD的分子特征奠定了基础。

参考文献

1. Troy M. Robinson., et al., Single-cell genotypic and phenotypic analysis of measurable residual disease in acute myeloid leukemia. Science Advances (2023).