前言

研究表明，过早终止密码子（PTCs）是导致10%-20%遗传性疾病的原因，也是癌症中肿瘤抑制基因失活的重要机制。PTCs引发的蛋白质截短通常导致功能丧失，且许多PTCs会通过无义介导的mRNA衰减（NMD）引发mRNA转录本降解，从而减少截短蛋白质的产生。基于此开发的无义抑制疗法能通过帮助细胞忽略或“通读（readthrough）”蛋白质生产过程中出现的停止指令，有效抑制NMD，防止蛋白质翻译过早终止。

目前已发现多种促进PTC通读的小分子药物，通过不同的作用机制促进近同源tRNA对终止密码子的识别，且对于多种疾病基因，适度通读即可缓解动物模型的疾病症状，但由于许多PTCs的无效通读，阻碍了其向临床的转化。

近日，巴塞罗那生物医学研究所和基因组调控中心的研究团队分析了8种不同促进通读的药物对约5800个人类致病PTCs的通读情况，确定了多个预测PTC通读疗效的局部序列决定因素，并利用这些序列决定因素建立计算模型（RTDetective），准确预测药物诱导的全基因组通读。研究团队通过量化内源性终止密码子通读验证了该模型，以增强临床试验设计和个性化无义抑制疗法的开发。该研究以“Genome-scale quantification and prediction of pathogenic stop codon readthrough by small molecules”为题发表在Nature Genetics上。

文章发表在Nature Genetics

为了量化不同药物诱导的多样化PTCs的通读，研究团队构建了包含3498个导致孟德尔遗传病的PTCs（ClinVar）、2372个复发性体细胞 PTCs（721个来自TCGA；1651 个来自MSK - IMPACT）及1个TP53对照无义突变（n = 5871）的文库。将每个PTC及其周围144个核苷酸（nts）的序列背景克隆到一个双荧光蛋白报告细胞中，并在HEK293T landing pad（LP）细胞系中进行单拷贝基因组整合，结果显示通读效率在重复实验中高度相关，且在HEK293T_LP、MCF7和HeLa三种类型细胞中，不同突变之间的通读效率高度相关，该检测结果与在其他实验室进行的包含不同基因和药物的定量分析结果相吻合（图1）。

图1.定量通读数千种致病性PTCs

研究团队对20种已知能诱导通读的不同浓度药物进行了分析，其中8种药物（CC90009、clitocine、2,6-diaminopurine (DAP)、gentamicin、G418、SJ6986、SRI-41315和5-fluorouridine (FUr)）在实验中诱导了可重复的通读，这些药物包括不同类别的小分子，涵盖不同的作用机制。不同药物对PTCs的通读促进效果差异显著，且每种药物对特定PTCs子集有更强的通读促进作用。

为了更好地理解为什么特定的药物会促进特定PTCs的通读，研究人员量化了所有药物的通读和47个序列特征之间的关联，这些特征包括终止密码子类型、相邻的下游和上游核苷酸、与密码子相关的指标以及一般特征（如G+C含量和RNA二级结构倾向）。与先前观察结果一致，特定类型终止密码子对药物诱导的通读作用更强，但不同药物差异大，如对G418和SRI，通读效率为UGA>UAG>UAA；对clitocine，通读效率为 UGA>UAA>>UAG；对DAP，通读效率为UGA>>UAG~UAA，作用方向相同的药物也可能具有不同的作用强度（图2）。

此前研究表明，终止密码子的上游密码子在无药物条件下可调节通读。通过上游密码子对文库中的序列进行聚类，研究揭示了每种药物的上游偏好。此外，以A结尾的密码子在促进通读方面表现更好，且不同氨基酸间影响不同。

图2.序列特征解释PTCs和药物之间

研究建立的文库共包含240个基因组位置，每个位置包含两种代表不同终止密码子类型的突变（即“多终止突变”），根据所比较的药物和终止类型，终止突变对之间的通读相关性范围在约0到0.85之间，在不同药物处理下，同一基因组位置的不同终止密码子突变如图3a所示，证实了特定突变对特定药物的敏感性差异。为每个突变选择最佳药物时，50.3%的PTCs可实现超2%通读率，高于任何单一药物，基于基因信息的药物选择可以使更多突变实现更高的读通率，其中27%的PTCs通读率大于3%，11%的PTCs大于4%，3.2%的PTCs大于5%，1.6%的PTCs大于6%（图3b）。比较每种药物前50个最敏感变体显示，每种药物使不同变体组的通读最大化，所有成对比较中平均有13个变体重叠（图3c）。因此，最佳药物的选择取决于每位患者中引起疾病的特定无义突变。

随后研究者探究了不同药物对常见肿瘤抑制基因TP53和PTEN中PTCs通读的影响。对于TP53，五种最常见的PTCs占比高且有通读治疗潜力，不同PTCs对不同药物反应不同，总体上，对于TP53中43/102的PTCs，至少有一种药物可实现通读率大于2%。而PTEN总体上有35/97的PTCs可通过至少一种药物实现大于2%的通读率（图3d）。研究分析了在无义抑制临床试验中常靶向的三个基因：DMD、CFTR和APC，数据显示对这些基因最有效的通读药物是clitocine和DAP，在所有三种基因中，与患者PTCs匹配的药物组合可以实现更高的读通率（图3f）。

图3 通读敏感型无义变体因药物而异

研究团队基于六种在超过3%的PTCs中引发大于1%通读的药物训练了基于序列的基因型-表型模型——RTDetective。该模型优化后，使用四个序列特征组的简单模型在六种药物中表现良好，特征组包括终止密码子类型、PTC下游的三个核苷酸及其相互作用、PTC上游的三个核苷酸及其相互作用、终止类型与PTC下游三个核苷酸的相互作用（图4）。训练计算模型需要大量的数据，研究团队测试了数千种药物和终止密码子的组合，产生了超过14万次的单独检测。

图4.可解释模型从序列背景预测通读效率

通过这六种药物，可以对人类基因组中3270万个位点中的1300万个（39.6%）实现>2%的通读，对2860万个位点（87.3%）实现>1%的通读。不同药物对无义突变密码子实现大于2%通读率的比例不同，考虑所有可能的PTCs，最有效的药物是DAP（32.8%），其次是clitocine（30.5%）、SJ6986（29.5%）、SRI（6%）和G418（1.1%）。特定药物与终止密码子类型的组合在DMD、PTEN和TP53基因中显示出治疗潜力。（图5）。因此，药物诱导的通读可作为一种有希望的治疗策略，关键在于为每个PTC匹配正确的药物。

图5.人类基因组的计算机模拟无义饱和突变

综上所述，该研究分析了8种药物对约5800个人类致病性终止密码子的通读影响，数据来自于ClinVar和癌症基因组图谱等大型公共数据库的患者报告。研究团队基于局部序列背景的影响，建立了计算模型RTDetective，该工具可能有助于无义抑制疗法药物临床试验的设计、开发和疗效评估。

桑格研究所Ben Lehner博士表示：“如果一个病人被诊断患有遗传病，就可以通过基因检测确定确切的突变，然后根据计算机模型建议使用哪种药物实现最有效的治疗。这种明智的决策是我们希望在未来开启的个性化医疗。当发现一种新的通读药物时，我们可以使用这种方法快速建立一个模型，并确定所有最有可能受益的患者。”

论文原文：

Toledano I, Supek F, Lehner B. Genome-scale quantification and prediction of pathogenic stop codon readthrough by small molecules. Nat Genet. 2024. https://www.nature.com/articles/s41588-024-01878-5