1926年3月18日，在北京铁狮子胡同段祺瑞执政府门前，军警向手无寸铁的请愿学生开枪射击，用大刀砍杀，当场打死47人。死者中有共青团员８人。北京女子师范大学的女生刘和珍、杨德群和燕大的女生魏士毅等在这场运动中牺牲。在死难烈士中，有７个是中学生，最小的年仅13岁。这就是震惊全国的“三·一八惨案”。鲁迅称这一天是“民国以来最黑暗的一天”。

“大沽口事件”中所暴露出来的帝国主义的野蛮行径，点燃了中国民众的怒火。在中共北方区委的领导下，立即掀起了抗议活动。八国最后通牒消息传出后，群众的愤怒到了极点，提出“似此横暴，于斯以极，此而不争，国亡无日，望我同胞，共起反抗，以制凶顽，用雪国耻”。

3月17日下午，国民党北京特别市党部、北京学生联合会、北京总工会等200余团体的代表，在北京大学三院召开紧急联席会议，定于18日上午10时在天安门召开国民大会，并推举李大钊、李石曾、顾孟余、徐谦等13人组成主席团。会后，代表分成两路，一路由共产党员王一飞、安体诚率领去外交部请愿。另一路由共产党员、北京学生联合总会党团书记陈毅率领，去国务院请愿。结果赴国务院请愿代表与临时执政府卫队发生冲突，致使多人受伤。

3月18日，天低云暗，清晨，中共北方区委在李大钊的主持下又召开紧急会议，检查国民大会准备情况，赵世炎、陈乔年等分别报告群众的组织和发动情况，拟定了标语口号，以及游行路线。上午10时，北京总工会、总商会、学生总会等140多个团体，和北大、清华等80余所大中小学校的学生，共计3万余人（另有10万人、5000人之说），冒着风雪，来天安门广场举行“抗议八国最后通牒”的国民大会。主席台上悬挂着前一天请愿受伤代表的血衣，旁边写着“段祺瑞铁蹄下之血”8个醒目的大字。

大会首先由国民党北京特别市党部代表徐谦报告开会宗旨。继由顾孟余、王一飞等报告并发表演说。李大钊在会上慷慨演说，号召大家用“五四精神”、“五卅热血”，反抗帝国主义和军阀，惩办大沽口事件的罪魁祸首。会上群情激愤，一致通过“驳回最后通牒，驱逐八国公使”等6条决议。

中午12时大会结束后，由2千多群众组成请愿团，按原定计划向铁狮子胡同段祺瑞执政府出发。共产党人李大钊、赵世炎、陈乔年、陈为人等也在游行队伍之中。共产党员王一飞为游行总指挥。下午1时20分，游行队伍到达执政府门前，数百名荷枪实弹的士兵环立。见此情景，请愿群众立即在国务院门前停下，推丁惟汾、王乐平等5人持名片前去交涉，要求会见段祺瑞和总理贾德耀，遭到卫队阻拦。

就在群众人声鼎沸、群情激昂时，“府卫队长官忽发口令说：'向中间开枪'” ，一时警笛狂鸣，东西辕门卫兵向群众平射，民众纷纷后撤，士兵们手持马刀、刺刀、铁棍追击砍杀。国务院门前尸横遍地。当场打死手无寸铁的群众47人，重伤155人，轻伤难以计数，酿成空前悲壮的三一八惨案。

当晚，李大钊、陈毅等召开了中共北京党组织和共青团组织紧急联席会议，决定斗争到底。陈毅又在北大一院召开了200多个团体代表参加的联席会议，讨论有关善后事宜。会议推广州外交代表团、中国济难会等7个团体组成“北京惨案后援会”，负责处理善后事宜。医科学生组织了临时救护队，奔赴国务院、北大等地进行抢救。为抗议政府暴行，3月19日，北京各学校一律停课。23日，在北京大学三院，北京各界在北京大学举行追悼大会，会场高悬“先烈之血、革命之花”8个大字，会后还举行了抬棺游行。

惨案发生后，段祺瑞政府连夜召开紧急会议，忙于推卸罪责，反诬群众领袖制造事端。3月19日颁了一份通缉令，通缉严拿徐谦、李大钊等5人。中共发表《为段祺瑞屠杀人民告全国民众书》，全国掀起了抗议段祺瑞政府和哀悼死难烈士的高潮。

“三一八惨案”发生后，中国知识分子和媒体同仇敌忾，表现出前所未有的社会良知。周作人、林语堂、朱自清、蒋梦麟、王世杰、闻一多，以及正在住院的梁启超，这些著名知识分子纷纷谴责段祺瑞政府。刘半农作词、赵元任谱曲的《哀歌》唱遍京城；鲁迅更是激愤不已，为这一惨案连续写了7篇檄文，名垂青史的《纪念刘和珍君》便是其中之一。

强大的民意压力也启动了形同虚设的国会和司法，曾被讥为“花瓶”的国会也破天荒地召集非常会议，通过了屠杀首犯“应听候国民处分”的决议；京师地方检察厅对惨案进行了调查取证，并发表正式认定：“此次集会请愿宗旨尚属正当，又无不正侵害之行为，而卫队官兵遽行枪毙死伤多人，实有触犯刑律第三百十一条之重大嫌疑。” 并迫使段祺瑞颁布对死难者家属“抚恤令”，国务院阁员总辞职。

惨案发生时，临时执政段祺瑞不在现场。段祺瑞的女儿段式巽认为：“三一八”时段祺瑞曾下令不准开枪，但贾德耀置之不理，终于酿成血案，后来段祺瑞为之“长斋礼佛，以示忏悔”。 还有回忆称段祺瑞在悼念三一八惨案死难同胞大会上，当众长跪不起。 这些传闻流传甚广，却未必经得起仔细推敲。 段祺瑞在“三一八惨案”中究竟是否主谋，目前仍难有定论。但无论如何，段祺瑞作为政府首脑，对于惨案的发生难辞其咎。毛泽东曾明确表示：“不难想象，没有段的命令，贾敢下令向学生开枪吗？至于吃斋念佛，不少下台军阀都是这样做的，不过是故作姿态罢了。”

可以肯定的是，段祺瑞政府当时已处于风雨飘摇之中，其本就有限的合法性资源，更因为“三一八惨案”丧失殆尽。一个月后，段祺瑞政府就在一片谴责声中宣告倒台。