导读

DNA甲基化是一种重要的表观修饰，在调控基因的时空特异性表达中扮演着关键的角色，参与了X染色体失活、基因组印记和重复序列抑制等诸多生命过程。其中，真核生物中最常见的DNA甲基化修饰是5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化改变与癌症及其他许多疾病的变化、进展密切相关，已有研究表明一些基因的甲基化模式具有临床意义，可以用于相关的预后、诊断和预测等。

目前，对DNA甲基化进行全面分析仍具有挑战性。由于在扩增过程中无法维持甲基化模式，使用标准PCR方法不能直接分析DNA甲基化。迄今为止，DNA甲基化模式的分析通常依赖化学或酶促预处理，但这两种预处理过程耗时较长，并且可能会因处理不完全造成结果偏差。

近日，丹麦PentaBase生物科技公司的研究团队及其合作者在Nature Communications发表了题为“A qPCR technology for direct quantification of methylation in untreated DNA”的文章。研究团队提出了一种新型qPCR技术——EpiDirect®，其基于嵌入性核酸（INA^®）经特殊引物设计后可区分甲基化和未甲基化胞嘧啶这一原理，能够使用未处理的DNA直接进行DNA甲基化的PCR定量。利用这项技术，研究团队还开发了一种分析MGMT启动子区域甲基化状态的方法，可用于胶质母细胞瘤患者的治疗选择和预后。与依赖亚硫酸氢盐的甲基特异性PCR方法相比，EpiDirect®具有高灵敏度、高特异性和临床实用性。

文章发表在Nature Communications

研究团队利用5mC和DNA技术INA®之间的协同效应，开发了一个PCR平台EpiDirect®，可直接定量DNA甲基化，而无需对DNA进行任何预处理。在EpiDirect®平台中，双链DNA通过Watson-Crick碱基配对和碱基堆积来维持稳定。其中后者是DNA双螺旋结构的主要稳定剂，也被称为“π-堆积”；5mC则被证明会影响DNA双链的热稳定性。INA®包含至少一个核碱基类似物，称为嵌入性假核苷酸（IPN），IPN将与邻近的核碱基同轴堆叠，从而提高DNA解链温度（Tm）。

与胞嘧啶相比，由于INA®部分在5mC下的堆叠不同，导致堆积效应出现明显差异，即甲基化DNA比非甲基化DNA的热稳定性强，利用该效应可直接检测和量化DNA甲基化。此外，EpiDirect®还采用一种特殊的引物设计，称为EpiPrimer™，可对甲基化DNA进行选择性扩增。如图1所示，EpiPrimer™由三部分组成：锚定序列、环状序列和起始序列。

图1. 进行甲基化DNA选择性扩增的EpiDirect®平台原理。

为研究荧光INA®探针、DNA探针（即Ref）对互补寡核苷酸热稳定性的影响，研究团队评估了两种不同的IPN分子（IPN1和IPN2），并将其耦联到MGMT启动子5'到CpG位点5' -CGTCCCGACGCCCG-3'的14个核苷酸序列上。IPN1修饰的探针表示INA-1，IPN2修饰的探针表示INA-2。结果显示，与Ref相比，使用INA-1后Tm提高了7.3°C，使用INA-2后Tm提高了7.8°C，表明INA®提高了DNA热稳定性。

图2. INA®可提高DNA寡核苷酸双链的解链温度。

研究团队将Ref探针与未甲基化（UM）和完全甲基化（M）靶标杂交并加热以获得Tm，发现与未甲基化CpG位点相比，甲基化CpG位点的Tm增加了约4.3°C。这一数据表明，甲基化CpG位点提高了DNA的热稳定性。

图3. DNA热稳定性受甲基化的影响。

接下来，研究团队分析靶序列中的DNA甲基化对INA®探针熔解性能的影响。如图4所示，与靶标UM相比，INA-2与靶标M结合时Tm高11.0°C，这表明INA®与DNA甲基化之间存在协同作用，可影响DNA双链稳定性。

研究团队发现与添加更多的甲基化位点相比，从无甲基化位点到添加一个甲基化位点对Tm的影响更大。此外，在靶序列中，将甲基化位点的数量从1个增加到4个时，每增加一个甲基化位点Tm将提高0.6℃。

图4. INA®和CpG甲基化的协同热效应。

研究团队使用42个脑肿瘤FFPE样本，将EpiDirect® MGMT甲基化qPCR检测方法与其他两种方法进行了比较，以检测甲基化调用情况，包括甲基特异性PCR测定和凝胶电泳（方法1）以及实时定量MSP测定（方法2）。结果显示，有31个样本在上述三种方法中显示出相同的结果；剩余11个样本在两种方法中显示一致，特别的，5个样本在EpiDirect®和其他一种方法中显示一致。综合比较分析结果显示，EpiDirect® MGMT甲基化qPCR检测方法的灵敏度为0.86，特异性为0.83。

图5. EpiDirect® MGMT甲基化qPCR检测方法的验证数据。

EpiDirect®方法的PCR条件目前仍存在一些局限性：为在甲基化和非甲基化靶标之间具有最高区分度，MGMT序列需要76°C的退火温度；退火到目标CpG位点的锚序列为14个核苷酸，如果锚定序列CpG含量较高或长度更长，PCR的退火温度将更高。

综上所述，研究团队开发了一个仅使用qPCR技术来定量未处理DNA甲基化的平台——EpiDirect®。在常规诊断中引入EpiDirect®平台，可节省检测实验室宝贵的时间，并能够克服亚硫酸氢盐处理过程中DNA转化不完全或过度转化的问题；EpiDirect®平台还可用于检测其他靶基因的甲基化。总之，EpiDirect®平台激发了甲基化分析的应用潜力，有望帮助资源有限的小型实验室实现独立的甲基化分析。

参考来源：

Bendixen, K.K., Mindegaard, M., Epistolio, S. et al. A qPCR technology for direct quantification of methylation in untreated DNA. Nat Commun 14, 5153 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40873-y