【佳作分享】中山大学庞冀燕团队JMC论文:通过自噬体锚定嵌合肽靶向降解α-突触核蛋白

时间:2023-11-02 20:40:51   热度:37.1℃   作者:网络

α-突触核蛋白(αSyn)在帕金森病和多系统萎缩等突触核蛋白病中扮演着关键的角色。这些疾病的病理特征包括多巴胺能神经元中αSyn的错误折叠和路易小体的异常积聚。因此,针对αSyn的干预被认为是治疗突触核蛋白病的一种策略,而传统的药物化学方法通常难以有效作用于αSyn,大多数调控αSyn的方法通常只能通过影响相关途径中的其它靶点来进行干预。中山大学庞冀燕团队开发了一项名为自噬体锚定嵌合体(ATACC的策略,该策略通过一种具有微管相关蛋白-1轻链-3BLC3B)结合区域(LIR)的双功能肽的协助,使感兴趣的蛋白(POI)能够锚定到自噬体膜上的LC3B,从而实现了POI的选择性自噬。该团队设计并合成了一系列的αSynATACC肽,它们能够通过化学诱导的载体识别的方式劫持自噬-溶酶体降解机制,特异而高效地降解αSyn,可作为一种针对突触核蛋白病的潜在治疗策略。近期,该项研究工作发表在美国化学会出版的药物化学核心期刊Journal of Medicinal Chemistry上(J. Med. Chem. 2023, 66, 17, 12614–12628)【1】。

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在此研究中,研究人员开发了一种名为自噬体锚定嵌合物(ATACC的策略:通过化学诱导的载体识别,将感兴趣的蛋白(POI)通过嵌合肽的帮助锚定到自噬体上,从而促进POI的选择性自噬(图1a)。ATACC肽包括三个主要部分(图1b):一个PBD(蛋白结合区域),一个LIR(LC3结合区域),以及CPP(穿膜肽序列)PBDLIR通过一个通用的linkerGSGS)连接, 而N-末端修饰可作为检测标签。

具体来说,对αSyn的选择性识别是通过βSyn的片段(GVLYVGSKTR)实现的,其能够以高度特异性的方式与αSyn结合。另一方面,为了实现对LC3B的精确锚定,选取了三个天然选择性自噬受体中的LIR基序进行ATACC肽的设计:p62的残基332–343SGGDDDWTHLSS),NBR1SASSEDYIIILP)的残基726-737OptineurinGSSEDSFVEIRM)的残基172-183。对于CPP,选择了人类免疫缺陷病毒反式激活转录激活剂(TAT)(YGRKKRRQRRR)和聚-D-精氨酸(polyR)(RRRRRRRR)的残基47-57,设计的ATACC肽的序列如图1c所示。生物层干涉测量(BLI)检查嵌合肽(P1P2P3P4)与靶蛋白的亲合力。结果表明四种ATACC肽都可以与αSynLC3B结合(图1d)。其中,P1αSynLC3B的亲合力最强, KD分别为 8.83 ± 0.56  14.9 ± 1.2 μM

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1:(a ATACC肽诱导的POI靶向降解;bATACC肽的结构图和(c)序列;(d BLI测定ATACC肽与LC3B/αSyn亲合力

HEK293T细胞中,四种ATACC肽均能诱导αSyn的剂量依赖性降解,降解能力最强P1DC50 46.8 ± 3.7 μM(图2a2b)。为了阐明P1诱导的αSyn降解的机制,研究人员构建了表达LC3B-EGFP融合蛋白和αSyn-EGFP融合蛋白的HEK293T顺转细胞株,在罗丹明标记的P1共孵育2小时后的细胞成像结果表明,ATACC肽与LC3BαSyn高度共定位(图2f),佐证了P1能与LC3BαSyn结合。免疫共沉淀(co-IP)和细胞热迁移(CETSA)实验也进一步验证这些相互作用(2c-2e)

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2:(a)免疫印迹测定P1HEK293T细胞中αSyn的降解作用;bP1P2P3  P4的剂量-效应曲线和DC50值;(cFLAG-P1和(dP1处理后,HEK293T细胞中LC3BαSynCo-IP分析;(e) CETSA实验;(fRhoB-P1处理表达LC3B-EGFPαSyn-EGFPHEK293T细胞2小时后的激光共聚焦成像

接着,研究人员评价了P1SH-SY5Y细胞系的保护作用。激光共聚焦和细胞流式结果表明,在P1处理后,细胞中的活性氧ROS水平回落(从175.4±8.4下降到127.7±17.3%,图3a-c),而线粒体膜电位ΔΨm水平升高(从45.02±5.04提高到61.65±3.35,图3d-f)。此外,CCK-8实验结果表明P1以剂量依赖性方式挽救了αSyn过表达引起的细胞死亡。这些结果表明,P1可以抑制αSyn介导的ROS生成和ΔΨm损失,以保护SH-SY5Y细胞免受αSyn相关毒性影响。

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3:(a)激光共聚焦成像;(b)不同条件下DCFH-DA染色SH-SY5Y细胞的FCM直方图;(c) 对(a)中的图像进行定量分析;(d)激光共聚焦成像;(e)不同条件下JC-1染色SH-SY5Y细胞的细胞流式散点图;(f)对(d)中的图像进行定量分析;g)不同条件下SH-SY5Y细胞的CCK-8测试结果

最后,研究人员使用MPTP1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)诱导的PD小鼠模型评估P1的表现。在静脉注射P150 mg·kg–1·d–15天后,进行生化分析和组织学评估(图4a)。免疫组织化学(IHC)染色和免疫印迹分析表明, P1处理后,小鼠黑质致密细胞(SNc)中的αSyn水平降低(图4b-e)。此外,Nissl 染色显示 SNc 中神经元的活力有所改善(Nissl 小体密度增加,图 4f)。而FluoroJade B FJB) 染色显示 SNc 中受损神经元减少(图 4gi)。此外,行为学实验的结果表明P1的给药挽救了MPTP诱导PD小鼠的认知障碍。

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4P1MPTP诱导的PD小鼠模型中的治疗效果

小结

该论文作者报道了自噬体锚定嵌合物(ATACC技术,设计合成了一系列ATACC肽,并评估了它们与靶蛋白的亲合力和透膜性,验证了它们可通过“化学诱导的货物识别-ALP降解机制可以有效地降解αSyn。这项研究不仅展示了一种治疗突触核蛋白病的潜在策略,还提供了一种新的靶向蛋白降解工具,拓展了靶向蛋白降解技术的工具库。

参考文献

【1】Yichen Tong, Wentao Zhu, Jian Chen, Wenqian Zhang, Fang Xu, and Jiyan Pang. Targeted Degradation of Alpha-Synuclein by Autophagosome-Anchoring Chimera Peptides. Journal of Medicinal Chemistry 2023 66 (17), 12614-12628. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c01303.

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