免疫疗法是治疗癌症的有效方法，如过继细胞疗法（ACT）和免疫检查点阻断疗法（ICB）。CD8⁺细胞毒性T细胞（CTLs）协调抗肿瘤免疫，并表现出固有的异质性，前体耗竭前体T细胞（（T_pex））能够对现有免疫疗法有反应。作为CTL分化基础的基因调控网络以及终末耗竭T细胞（T_ex）的反应是否可以在功能上重新激活还不完全清楚。为此，美国圣裘德儿童研究医院迟洪波教授及其团队在体内使用单细胞CRISPR筛选系统地绘制了因果基因调控网络，并发现了CTL分化检查点。首先，T_pex细胞从静止状态中退出，开始向中间T_ex细胞连续分化。这一过程受到IKAROS和ETS1的不同调控，它们分别抑制和增加mTORC1相关的代谢活性。IKAROS-缺陷细胞在ICB后，作为一种代谢静止的T_pex细胞群积累，分化潜能有限。相反，靶向ETS1通过促进T_pex向中间T_ex细胞的分化和代谢重组，提高抗肿瘤免疫和ICB活性。在机制上，TCF-1和BATF分别是IKAROS和ETS1的靶点。第二，RBPJ-IRF1轴促进中间T_ex向末端T_ex细胞分化。因此，靶向RBPJ增强T_ex细胞向增殖状态的功能和表观遗传重编程，改善了治疗效果和疗效。总的来说，本研究表明，促进T_pex细胞从静止状态中退出和丰富增殖T_ex细胞状态是抗肿瘤感染的关键模式，并为整合细胞命运调节和可编程功能决定因素提供一个系统框架。相关研究成果以题为“Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer”的论文于2023年11月15日发表在最新一期《Nature》。

【肿瘤内CTLs的体内scCRISPR筛选揭示共同功能模块和基因程序的连通性】

为了建立共同功能模块和下游基因程序，首先通过比较172个TF扰动（与NTC相比），分析不同的基因表达模式。通过基于液滴测序来评估供体来源的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的单细胞sgRNA和转录组文库（图1a）。在42209个携带单基因扰动的细胞中，计算每个遗传基因扰动与NTC的比例，NTC显示肿瘤内CTL积累的阳性（Stat5a，Stat5b和Irf4）和阴性（Nr4a3和Fli1）调控因子（图1b）。确定了9个具有缩小或不同功能效应的共功能TF模块，以及4个与效应功能、衰竭、干性和增殖相关的共同调控基因程序（图1c）。这些基因程序在T_pex、T_ex和T_eff细胞簇中显示出不同的分子特征（图1d）。接下来可视化了9个共功能模块对4个共调控基因程序的扰动效应强度，并确定了6个模块（M2、M3和M5-M8）具有显著效应（图1e）。以上结果表明，这些模块对效应功能、衰竭、干性和增殖程序具有复杂但协同的影响。为了揭示模块内和模块间的调节电路，在6个主要模块之间生成一个聚焦的GRN，并评估相互作用强度（图1f）。Rbpj、Ikzf2和Klf13（M8）、Runx3、Ikzf1和Nfat5（M3）、Foxo1（M6）、Tcf7、Myb和Ets1（M7）、Bach2（M5）和Id2（M2）在各自的模块中具有较大的调节作用（图1g），因此它们是中心枢纽TFs。鉴于在慢性感染中对中间性和暂时性T_ex细胞的鉴定，将T_pex和T_ex簇分为前体耗竭样状态1（T_pex1）、T_pex2、末端耗竭样状态1（T_ex1）和T_ex2细胞，通过伪时间分析预测了从T_pex1到过渡性T_pex2和T_ex1细胞状态到T_ex2细胞的轨迹（图1h、i）。此外，T_pex1细胞状态表达的干细胞相关基因，这些基因在分化过程中逐渐下调（图1j）。

图1 肿瘤内CTLs的体内scCRISPR筛选揭示共同功能模块和基因程序的连通性

【IKAROS-TCF-1轴在T_pex细胞静止时退出】

表达Ikzf1 sgRNA（sgIkzf1）的OT-I细胞显示出有效的Ikzf1基因靶向性，并在转移后第7天在TME中显著积累（图2a）。在Ikzf1扰动后，T_pex细胞增加，而T_ex细胞的百分比减少，但数量没有减少（图2b）。因此，IKAROS促进T_pex向T_ex细胞分化。scRNA-seq分析显示，sgIkzf1 OT-I细胞在转录上与sgNTC OT-I细胞不同，含有更多的T_pex细胞，特别是T_pex1细胞，但T_ex细胞较少（图2c）。伪时间分析显示，sgIkzf1细胞主要在T_pex1细胞状态下积累（图2d）。事实上，sgIkzf1 T_pex细胞在转移后第7天表现出mTORC1相关特征降低和MitoSOX及增殖标志物水平降低（图2e、f）。与sgNTC OT-I细胞不同，sgIkzf1 OT-I细胞在抗PD-L1处理后没有增加，也没有显示出分化状态的改变（图2g、h）。在抗PD-L1处理后，sgIkzf1细胞也没有上调IFNγ或GZMB的表达（图2i）。ATAC-seq分析显示，sgIkzf1 T_pex细胞显示出T_pex选择性开放染色质区域（ocr）可及性增加，但T_ex选择性ocr的可及性降低（图2j），表明干细胞相关的增强，衰竭相关的表观遗传程序减少。共同靶向Ikzf1和Tcf7纠正了T_pex细胞的改变和在Ikzf1缺陷细胞中观察到的T_pex与T_ex细胞的比例（图2k、l）。以上结果表明，IKAROS主要通过抑制TCF-1来影响T_pex向T_ex细胞的分化。

图2 IKAROS促进T_pex1细胞的静止退出

【ETS1-BATF轴限制T_ex1细胞的生成】

为了研究ETS1在CTL异质性中的作用，有效地靶向OT-I细胞中的Ets1，并进行scRNA-seq。Ets1缺陷细胞显示T_ex1细胞扩增，同时T_pex细胞比例减少（图3a）。此外，Ets1缺失增强TME中OT-I和T_ex细胞的积累，但没有增强脾脏或tdLN（图3b、c）。肿瘤内Ets1缺陷细胞也显示出与效应功能、细胞毒性和增殖相关的标记物的表达增加（图3d、e）。在转移Ets1缺陷的T_pex细胞后，由T_pex细胞产生的总OT-I和T_ex细胞数量增加，这一发现与更广泛的增殖相关（图3f）。为了测试治疗效果，进行过继细胞治疗实验。转移Ets1缺陷的OT-I细胞或pmel细胞分别降低B16-OVA和B16-F10肿瘤的生长（图3g、h）。针对人CD19（hCD19）的Ets1缺陷CAR-T细胞在表达hCD19的B16肿瘤中也显示出更高的治疗效果（图3i）。与B16-OVA和E.G7-OVA肿瘤中的对照组相比，联合治疗缺乏Ets1细胞的抗PD-L1增强抗肿瘤作用（图3j），表明在CD8⁺ T细胞中靶向Ets1增强了ICB反应。在晚期基底细胞癌（BCC）患者的CTLs的scRNA-seq分析中，抗PD-1治疗诱导激活的CD8⁺ T细胞群的ETS1和IFNG表达水平降低（图3k）。TF基序富集和足迹分析显示，Ets1缺陷的细胞增强了BATF的活性，BATF是CTL效应功能的有效调节因子（图3l）。将转导sgNTC、sgEts1、sgBatf或sgEts1和sgAT-I细胞的OT-I细胞转移到B16-OVA荷瘤小鼠中，发现靶向Ets1和Batf逆转了总细胞和T_ex细胞积累的增加（图3m）。Batf共靶向也逆转了GZMB⁺、IFNγ⁺和Ki67⁺Ets1缺陷细胞百分比的增加（图3n）。因此，ETS1-BATF轴限制了T_ex细胞的积累和效应反应。

图3 ETS1是T_pex到T_ex1细胞过渡的关键

【RBPJ驱动T_ex1到T_ex2单元的转换】

本研究确定Rbpj扰动是增加T_ex1到T_ex2细胞比例的首选候选因素（图4a）。观察到在表达这些sgRNAs的细胞中，TME中OT-I细胞积累更大，而不是脾脏或tdLN（图4b）。Rbpj缺失增加了T_ex细胞的比例和积累，但降低了T_pex细胞的频率（图4c）。它也增加了T_ex细胞增殖，但没有改变细胞凋亡（图4d）。将sgNTC或sgRbpj细胞分别转移到荷瘤小鼠后，也观察到类似的效果（图4e）。因此，RBPJ选择性地限制了T_ex细胞在TME中的积累。在T_ex细胞中，OT-I细胞中RBPJ的表达高于其他肿瘤内或外周血的CD8⁺ T细胞群（图4f）。在T_ex细胞^5，9的二次转移实验中，Rbpj缺失增加T_ex细胞的积累，这与增殖增加相关（图4g、h）。接下来进行scRNA-seq分析，发现在Rbpj缺陷的细胞中，T_ex1细胞显著增加（图4i、j）。在伪时间分析中，基于Tcf 7和Entpd1的中间表达和Mki67的高表达，Rbpj缺陷细胞聚集在分化轨迹的中间（图4k），这通过增加Ki67⁺ T_ex细胞百分比来验证（图4l）。因此，Rbpj缺失导致T_ex1细胞的选择性积累。

图4 RBPJ驱动T_ex1向T_ex2细胞分化

【耗竭会增加RBPJ在人类癌症中的表达】

来自人类肿瘤组织的CD8⁺ T细胞中RBPJ增加，并在非小细胞肺癌（NSCLC）患者和结直肠癌（CRC）患者的瘤内CD8⁺ T细胞中与HAVCR2共表达（图5a）。来自黑色素瘤患者的瘤内CD8⁺ T细胞获得幼稚样、过渡性和功能障碍状态，RBPJ的表达从幼稚样细胞逐渐增加到功能障碍细胞（图5b）。Rbpj缺陷细胞增加了GZMB⁺和IFNγ⁺的频率和数量，也上调了穿孔素和其他效应相关分子的表达（图5c），表明细胞毒性和效应物的特征增强。根据其增强的效应功能，Rbpj缺陷的OT-I细胞更好地控制肿瘤生长，并延长B16-OVA荷瘤小鼠的生存期（图5d）。在将pmel细胞转移到B16-F10荷瘤小鼠后也观察到类似结果（图5e）。与单独治疗相比，这种策略增强了抗肿瘤效果（图5f）。Rbpj缺陷的CAR-T细胞在限制肿瘤生长方面提高了疗效（图5g）。与对照组相比，使用抗PD-L1的Rbpj缺陷OT-I细胞联合治疗E.G7-OVA荷瘤小鼠增强了抗肿瘤作用（图5h），表明在CTLs中靶向Rbpj也能促进淋巴瘤模型中的ICB反应。综上结果表明，在CTL中靶向Rbpj可诱导强大的抗肿瘤作用。对Rbpj缺陷的T_ex细胞中可及性增加的ocrTF基序分析发现，IRF1是最富集的基序，以及效应功能相关的TFBLIMP1和BATF16（图5i）。同时靶向Rbpj和Irf1可以减少Rbpj缺失导致的总OT-I和T_ex细胞的积累（图5j、k）。Irf1共靶向可以减轻sgNTC和sgRbpj细胞之间转录组谱的改变（图5l）。在验证实验中，这种共靶向逆转了由Rbpj缺失导致的Ki67⁺、GZMB⁺和IFNγ⁺ OT-I细胞百分比的增加（图5m、n）。以上结果表明，IRF1是Rbpj缺陷诱导的T_ex细胞增殖和效应功能和抗肿瘤作用所必需的。

图5 RBPJ缺乏促进CTL功能恢复

【总结】

综上所述，本研究提供了一个基于遗传电路和分子决定因素的肿瘤内CTL反应的功能异质性的系统框架，包括进行性CTL分化的三个检查点。研究结果强调了诱导T_pex细胞的静止退出和丰富增殖的T_ex细胞状态，以恢复CTL抗肿瘤反应的功能模式。值得注意的是，共同功能模块的模块内和模块间连接可能揭示未知的遗传相互作用，并扩展系统生物学中的通路映射，这种方法是可扩展的，适用于其他生物系统。总之，这些结果建立了TME中CD8⁺ T细胞进展分化的扰动图，并确定了T_pex和T_ex细胞功能重编程的公认可操作靶点，以改善癌症免疫治疗。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06733-x