真菌感染严重困扰了多达10亿人的健康生活，每年约150万人死于不同类型的真菌疾病¹。两性霉素B（amphotericin B，AmB）是一种由细菌产生的多烯大环内酯类抗生素，它能够与真菌细胞膜上的特有的麦角甾醇结合，使细胞膜透化、穿孔形成离子通道，造成细胞内容物的外漏，从而起到抗真菌的作用。AmB是目前临床上抗真菌谱最广且活性最强的抗真菌药物，但它对人体同样具有较高的毒性，尤其是肾毒性，仅能作为治疗真菌感染的最后手段，被认为是人类抗击真菌的“最后一道防线”。无论是为了扩充人类抗击真菌的“武器库”，还是为了减少用药的不良反应，针对AmB的结构优化与改造都是十分必要的。

美国Illinois大学Urbana-Champaign分校的Martin D. Burke教授与Wisconsin-Madison大学Madison分校的Chad M. Rienstra教授针对这一问题，运用固态核磁共振技术（solid-state nuclear magnetic resonance，SSNMR）在原子尺度揭露AmB通过与杀灭真菌细胞类似的方式提取细胞膜上的胆固醇，从而杀害肾脏细胞。进一步地通过对AmB的结构优化与改造实现了对麦角甾醇的选择性，优选分子AM-2-19表现出肾脏保护活性与广谱抗真菌活性。目前该化合物已被授权给Sfunga Therapeutics公司，并于近期进入I期临床试验。该项研究工作发表在了Nature期刊上（Nature 2023, Online ahead of print）²。

研究人员首先基于SSNMR技术，发现AmB通过自组装的方式形成海绵样的结构并快速从真菌细胞中提取麦角甾醇。与之类似的，AmB也能提取原代人肾脏细胞中的胆固醇，从而造成正常细胞的死亡。将AmB 与胆固醇预孵育能够有效减弱其细胞毒性。这一原子尺度的发现解释了AmB的肾毒性，因此选择性地提取麦角甾醇而不提取胆固醇被认为是一种合理的肾脏保护性的多烯类抗真菌药物的开发思路。通过对比AmB在无甾醇与结合甾醇的高阶晶格结构，研究者发现两者之间差异显著。结合了甾醇的自组装AmB分子间距更大，其中麦角甾醇与胆固醇分子中共有的3β-OH与AmB的C2’-OH距离在4 Å 以内，提供了直接的氢键相互作用，同时麦角甾醇相较于胆固醇与AmB之间还通过甾醇B环形成额外的π-π堆积作用。等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）实验表明，AmB对麦角甾醇的选择性要高于胆固醇（图1），因此研究者推测将C2’差向异构化能够一定程度上破坏与甾醇的结合，从而提高对麦角甾醇的选择性，分子动力学模拟也观测到了C2′-OH 和 3β-OH 之间的氢键相互作用被破坏。

图1、AmB对麦角甾醇的亲合力强于胆固醇

研究者随后通过11步路线合成了AmB的C2’差向异构体C2'epiAmB，ITC实验表明C2′epiAmB不与胆固醇结合，但仍然保留了与麦角甾醇结合的能力，尽管这种能力有所减弱。这种不与胆固醇结合的特性显著降低了C2′epiAmB对人类原代肾细胞的毒性。小鼠肾脏保护模型实验也表明C2′epiAmB（45 mg kg ^-1）在12倍于AmB（4 mg kg ^-1）的剂量下肾脏生物标志物才会升高，且肾脏组织病理学几乎没有变化，显著提高了生存率（图2）。

图2、C2′epiAmB肾毒性显著降低，模型鼠生存率显著升高

进一步的研究表明，C2′epiAmB的抗真菌活性要弱于AmB。然而与麦角甾醇亲合力的减弱并不能完全解释C2′epiAmB在不同真菌中效力减弱幅度的差异性。研究人员推测C2′epiAmB相较于AmB提取麦角甾醇的速率更慢，使麦角甾醇的生物合成能够弥补该损失而使抗真菌活性减弱。这一推测通过麦角甾醇的提取率实验得到证明，同时C2′epiAmB与麦角甾醇的生物合成抑制剂酮康唑的联合用药恢复了对C2'epiAmB 高度耐药的曲霉属菌株的 AmB 样活性与杀菌动力学（图3）。

图3、C2′epiAmB的麦角甾醇提取动力学较AmB更慢，解释了其抗菌活性的减弱，与酮康唑联用恢复与AmB相当的抗菌活性

研究者还发现将AmB中的C16的羧基转化为非离子化的官能团能够增加麦角甾醇提取动力学并提升抗真菌活性。因此通过将消除肾毒性的C2′差向异构化与提高活性的C16酰胺化相结合，即能产生一种新的具有肾脏保护性的强效多烯类抗真菌药物。研究人员将C2′差向异构化，同时以丝氨醇酰胺化C16得到活性衍生物AM-2-19。实验表明，该衍生物保留了对麦角甾醇的选择性，同时相较于C2'epiAmB能更快地提取麦角甾醇并杀死真菌。以AM-2-19的简单微胶束（AM-2-19_DP2K）给药的健康CD-1雌性小鼠中，单剂量高达45mg/kg的AM-2-19_DP2K未引起显著的临床生物标志物或肾脏的组织病理学变化。此外，AM-2-19_DP2K具有与AmB相当或更胜一筹的抗真菌活性与抗菌谱。

小结：AmB由于其较强的肾脏毒性使用范围受限，作者运用SSNMR技术基于原子尺度阐明了AmB的抗真菌活性机制与肾毒性机制，通过分析AmB与麦角甾醇以及胆固醇的结合模式将AmB差向异构化以优化对麦角甾醇的选择性。更进一步地，作者还通过对C16的酰胺化优化了对麦角甾醇的提取动力学，优选分子AM-2-19展现出了优异的抗真菌活性与极广的抗菌谱，该研究工作不仅获得了安全性良好的全新抗真菌化合物，同时也为合理优化其他多烯大环内酯抗生素，改善其耐药性提供了概念框架。

参考文献

(1) Bongomin, F.; Gago, S.; Oladele, R. O.; Denning, D. W. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. J Fungi (Basel) 2017, 3 (4). DOI: 10.3390/jof3040057.

(2) Maji, A.; Soutar, C. P.; Zhang, J.; Lewandowska, A.; Uno, B. E.; Yan, S.; Shelke, Y.; Murhade, G.; Nimerovsky, E.; Borcik, C. G.; Arango, A. S.; Lange, J. D.; Marin-Toledo, J. P.; Lyu, Y.; Bailey, K. L.; Roady, P. J.; Holler, J. T.; Khandelwal, A.; SantaMaria, A. M.; Sanchez, H.; Juvvadi, P. R.; Johns, G.; Hageman, M. J.; Krise, J.; Gebremariam, T.; Youssef, E. G.; Bartizal, K.; Marr, K. A.; Steinbach, W. J.; Ibrahim, A. S.; Patterson, T. F.; Wiederhold, N. P.; Andes, D. R.; Pogorelov, T. V.; Schwieters, C. D.; Fan, T. M.; Rienstra, C. M.; Burke, M. D. Tuning sterol extraction kinetics yields a renal-sparing polyene antifungal. Nature 2023. DOI: 10.1038/s41586-023-06710-4.