牙周炎是人类第六大流行疾病，也是最常见的慢性炎症性疾病。中国70%以上的成年人患有牙周炎，全球严重牙周炎患病率为11%。牙周炎是由生物膜积累引起的牙周生态失调引起的，随之而来的免疫微环境失衡和持续的组织损伤，导致牙龈出血、牙周袋形成、牙齿移动，最终导致牙齿脱落。此外，牙周炎被广泛报道对全身性疾病有重大影响，包括糖尿病、动脉粥样硬化和慢性肾脏疾病。

以往的研究报道了牙周炎与全身性疾病之间复杂的双向关系。来自牙周组织的促炎细胞因子、免疫细胞、细菌及其代谢物可通过循环系统传播到远处的器官和组织，从而诱发或加重许多全身性疾病。此外，全身性疾病可增加牙周炎的风险，并通过增强活性氧(ROS)、训练后的免疫适应不良和潜在的神经免疫机制影响牙周治疗的有效性。因此，预防和治疗牙周感染可以对患者的整体健康产生积极的反馈循环。然而，在急性感染和全身性疾病患者中，常规的非手术或手术治疗可能无法获得满意的治疗效果，因此迫切需要一种辅助治疗，如电针和不同药物(褪黑激素、次氯酸盐或氯己定等)的应用，这些药物在临床附着水平和抗炎作用方面有不同的结果。

褪黑素在医学领域经常被用作抗炎和抗氧化的辅助疗法;然而，在牙科领域的研究很少。当褪黑素从松果体分泌到血液中时，它会被动地扩散到口腔的唾液中。进入唾液的褪黑激素占血液总量的24% - 33%不等。在口腔中，褪黑激素被认为是骨转换的调节剂和免疫调节剂，已在唾液、龈沟液(GCF)和牙龈组织中检测。褪黑素的这些作用与牙周炎的治疗密切相关。事实上，最近的基础研究和临床研究表明，褪黑素可能对牙周炎有潜在的治疗作用。在动物实验中，褪黑素显著减少实验性牙周炎大鼠下颌骨中性粒细胞的浸润，消除氧自由基，减少促炎细胞因子的分泌，减轻对牙周组织的破坏。在人体研究中，Hesam等人发现，牙周炎患者在每晚睡前口服10mg褪黑素6个月后，牙周探诊深度明显减少，探诊出血明显改善。此外，研究发现，在常规牙周清洁后，口服褪黑素作为辅助药物对2型糖尿病合并慢性牙周炎患者的牙周状况和血糖控制有积极作用。然而，褪黑素辅助治疗牙周炎的确切机制和潜在靶点尚不清楚，需要进一步探索。我们的原假设是褪黑素对牙周炎没有潜在的治疗作用。

随着生物信息学时代和大数据时代的到来，网络药理学已成为信息科学和医学领域创新的重要工具。网络药学是从生物网络的角度解释疾病机制和药物作用机制的一门新兴学科。如今，网络药房在理论基础和算法开发上都取得了重大突破，在传统和现代医学研究中得到了广泛的应用。本研究拟从四个方面探讨褪黑素治疗牙周炎的作用及机制。首先，网络药理学分析用于预测牙周炎治疗期间褪黑素的潜在药理学靶点。然后，应用分子对接方法验证褪黑素与选定关键基因的结合能力。第三，在结扎性牙周炎小鼠模型中验证褪黑素的治疗效果和机制。最后，在LPS (Escherichia coli, Sigma, L2755, 10 μg/mL)刺激的HL60细胞模型(中国，Procell)中验证褪黑素对筛选的治疗靶点的直接作用。

材料和方法:在本研究中，我们首先从Pharm Mapper中筛选推测靶点，从Drug Bank中筛选已知靶点，从TCMSP数据库中筛选已知靶点。然后，检索疾病数据库，筛选与牙周炎相关的差异表达基因。疾病与褪黑素相关基因的交叉产生了褪黑素治疗牙周炎的潜在靶基因。通过蛋白-蛋白相互作用网络和GO/KEGG富集分析进一步研究了这些靶基因。此外，通过分子对接模拟研究褪黑素与关键靶基因之间的相互作用。然后，我们进行了动物实验，通过向结扎性牙周炎(LIP)小鼠腹腔注射褪黑素来验证褪黑素的治疗效果。使用Western blot和免疫荧光技术分析褪黑素对预测靶蛋白的影响。最后，我们构建了体外细胞模型，并通过qPCR验证了褪黑素对预测靶点的直接影响。

引物列表

牙周炎中潜在褪黑素靶点的筛选。(a)已知和潜在的褪黑素蛋白靶点网络。粉色:褪黑激素。绿色:已知目标。蓝色:模型预测的潜在目标。红色:预测和已知目标。(b)疾病数据库中与牙周炎相关的靶点(c)筛选牙周炎中褪黑素靶点的维恩图。(d) 8个交叉目标的PPI网络构建。

GO和KEGG对选定目标的富集程度。(a)柱状图显示了三组deg富集的前5个生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)项。(b) 8个交叉靶点与GO富集途径的相关性分析。(c)前8条富集的KEGG通路分析。(d) 8个交叉靶点与keggenrich通路的相关性分析。

韦恩图中八个交叉靶点与褪黑素的分子对接

(a)结扎性牙周炎和Mel治疗实验的时间轴。(b)结扎性牙周炎及Mel治疗小鼠示意图。(c)牙槽骨Micro-CT扫描图像的三维重建。比例尺= 1 mm (d)牙槽骨丢失近中(左)和远中(右)CEJ-ABC距离的定量统计。(e)骨体积分数(BV/TV)和骨表面积比(BS/BV)的比较。(f)骨小梁分离(Tb.Sp)和骨小梁数目(Tb.N)的比较

(a) CTR、LIP和LIP + Mel牙龈组织中MPO表达的Western blot分析。(b)定量MPO表达，归一化为β-actin表达。N = 3。(c) CTR、LIP和LIP + Mel牙龈组织中MMP8和MMP9表达的Western blot分析。(d)定量MMP8和MMP9表达，归一化为β-actin表达。N = 3。(e)牙龈组织的免疫荧光图像。标尺，200 μm。放大(5.0×)。(f) HL60细胞诱导分化示意图。(g)三个关键靶点MPO、MMP8和MMP9的mRNA表达水平。

结果:通过网络药理学分析鉴定出8个潜在靶基因。富集分析表明，褪黑素可能通过抑制三个潜在靶点(MPO、MMP8和MMP9)的表达来治疗牙周炎。分子对接结果表明，褪黑素能有效结合MMP8和MMP9。随后，褪黑素在小鼠LIP模型中进一步验证了其抑制牙周组织中MPO、MMP8和MMP9表达的作用。最后，我们在体外细胞模型中验证了褪黑激素对MPO、MMP8和MMP9 mRNA表达的直接影响。

结论:本研究通过网络药理学与实验验证相结合，对褪黑素治疗牙周炎的机制有了更全面的了解。我们的研究表明MPO、MMP8和MMP9是褪黑素治疗牙周炎的关键靶基因。这些发现为进一步研究褪黑素治疗牙周炎的药理机制提供了更全面的基础。

原文来源：

Kamoran, Tuerhong;  Kehao, Liu;  Danfeng, Shen;Integrating network pharmacology and experimental evaluation to explore the complementary therapeutic effect and mechanism of melatonin in periodontitis.Heliyon 2024 Jun 30;10(12):e32494