肝纤维化（HF）是一个动态且高度整合的过程，涉及分子、细胞和组织层面，导致细胞外基质（ECM）成分的持续过度积累，并通过肌成纤维细胞的激活得以维持。心衰是慢性肝病（CLDs）的关键阶段，有可能进展为肝硬化，最终导致肝细胞癌（HCC）。有效的抗纤维化治疗具有显著的益处，即便对于终末期心衰患者亦是如此。然而，迄今为止，FDA尚未批准任何用于心衰治疗的药物。因此，在医学领域，迫切需要开发抗纤维化治疗以阻断CLDs的进展和HCC的发展。

芪甲柔肝汤（QJ）是一种具有保肝、抗纤维化作用的中药，主要功效在于补益元气、促进血液循环、消除停滞、疏通经络。然而，该药对肠道微生物群落及其代谢产物所产生的影响尚未明确。

近日，一篇名为“Gut microbes combined with metabolomics reveal the protective effects of Qijia Rougan decoction against CCl4-induced hepatic fibrosis”的论文揭示了QJ对CCl4诱导肝纤维化的保护效应。

图1 论文首页

QJ改善CCl4诱导的肝损伤

研究使用40%CCl4诱导HF模型，通过QJ给药6周，并采用血清生化分析、组织病理学、免疫组化、RT-PCR、16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学等技术来探究QJ对HF的干预作用。

肝功能检测结果表明，相较于对照组（C组），模型组（M组）的血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）以及碱性磷酸酶（ALP）的水平有显著的上升。经QJ处理后，这些指标的水平明显降低（图2B）。此外，QJ处理亦显著降低了HF患者的肝脏指数（图2C）。HE染色结果显示，对照组的肝细胞形态正常，排列紧密，且肝实质内未见明显的病理变化或炎症细胞浸润（图2A）。然而，CCl4处理后，肝细胞出现了明显的脂肪变性、炎症和坏死征兆，而QJ处理能够减轻这些病理变化。

该研究通过qPCR技术检测了各组肝脏炎症指数的变化，结果显示M组的IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高，而QJ处理显著抑制了这些炎症因子水平的上升，这进一步证实了QJ对CCl4诱导的肝脏炎症具有抑制作用（图2D）。

图2 QJ改善了CCl4诱导的肝损伤

QJ抑制ECM的产生

Masson染色及其半定量分析揭示，与C组相比，M组表现出大量纤维条纹及假小叶的形成，而QJ显著缓解了由CCl4诱导的肝纤维化。组织学层面，肝纤维化表现为肝脏结构的破坏及ECM的过度积累，其中I型胶原构成ECM的主要成分。肝星状细胞（HSC）的激活是ECM产生的主要细胞来源，而α-SMA则作为HSC激活的标志。

此外，研究通过IHC和qPCR技术检测了各组肝脏中I型胶原和α-SMA的表达水平。结果显示，M组中I型胶原和α-SMA的平均积分光密度值（IOD）及mRNA表达水平显著升高，然而经QJ处理后，这些指标显著降低（图3A、C、D）。上述结果证实了QJ对CCl4诱导的肝纤维化具有抑制效果。

图3 QJ可减轻CCl4诱导的肝纤维化

QJ改善肠道损伤并上调紧密连接蛋白的表达

C组回肠HE染色切片显示，肠组织结构呈现清晰状态，细胞形态保持正常，未观察到显著的炎症反应（图4A）。CCl4处理组显示出结缔组织排列稀疏，肠绒毛高度及隐窝深度均有所下降，并伴有炎症细胞的浸润。然而，经QJ药物治疗后，肠绒毛高度和隐窝深度得到恢复，且未见明显炎症反应。

紧密连接蛋白作为肠黏膜上皮细胞间的主要连接结构，对于保持肠上皮屏障的结构完整性和功能正常性至关重要。紧密连接的破坏可能导致肠道上皮屏障功能受损，进而使得肠道微生物及其代谢产物的转移，加剧已存在的肝病。研究指出，首次注射CCl4后，小鼠小肠中Occludin的表达显著减少，细菌易位（CCl4，4次）早于肠道微生物失衡（CCl4，24次；桥接纤维化）。肠上皮紧密连接蛋白的改变导致通透性增加，这可能是CCl4诱导肝损伤模型中早期细菌易位的原因。

Claudin-1、Occludin和ZO-1是肠紧密连接蛋白（TJPs）的关键组成部分。研究通过IHC和qPCR测定它们的平均积分光密度（IOD）值和mRNA表达水平。回肠的IHC分析结果（图4A、B）表明CCl4处理后Claudin-1、Occludin和ZO-1的平均IOD值显著下降。尽管如此，经QJ处理后，这些蛋白的表达水平得到恢复。此外，qPCR测量的mRNA表达结果与IHC结果相符（图4C）。结果表明，CCl4模型导致TJPs下调，这可能导致有害肠道微生物及其代谢产物通过肠肝轴影响肝脏，但QJ对CCl4诱导的肠上皮屏障损伤具有积极的修复作用。

图4 QJ改善肠道损伤并上调紧密连接蛋白的表达

QJ改善CCl4诱导的HF的代谢紊乱

为探究各组的代谢特性，该研究对肠道内容物样本执行了非靶向代谢组学分析。偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）揭示了C组与M组、M组与QJ组之间的分离现象。相应的置换检验验证了模型的有效性和可靠性，并未表现出过度拟合现象。火山图揭示了代谢物的差异（图5A、B）。基于M组与QJ组间差异代谢物的分析，研究探讨了QJ抑制HF的代谢途径。相关的KEGG途径包括药物代谢—细胞色素P450、脂肪酸降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及赖氨酸降解（图5D）。

在C组与M组、M组与QJ组之间，该研究共发现82种共同的差异代谢产物（共差异代谢产物），这些代谢产物均受到QJ的逆向调节（图5C）。在剔除KEGG、LIPID MAPS或HMDB数据库中未有注释的代谢物，以及未在HMDB中分类的代谢物后，剩余61种差异代谢物，这些代谢物可能是QJ抑制HF的关键代谢物。

图5 QJ改善了CCl4诱导的肝纤维化的代谢紊乱（n=3）

结论

综上所述，该研究揭示了QJ对CCl4诱发的肝脏炎症及纤维化具有抑制作用。此效应可能与肠道微生物群的调节、代谢紊乱的改善以及肠上皮紧密连接蛋白的优化相关。

参考文献：

Li X, Xu X, Tao S, Su Y, Wen L, Wang D, Liu J, Feng Q. Gut microbes combined with metabolomics reveal the protective effects of Qijia Rougan decoction against CCl4-induced hepatic fibrosis. Front Pharmacol. 2024 Mar 28;15:1347120. doi: 10.3389/fphar.2024.1347120