心血管疾病作为当前老年人群体死亡的主要原因之一，心力衰竭（HF）是其最为严重且危及生命的表现形式。尽管血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、血管紧张素受体/脑啡肽酶抑制剂（ARNI）、β受体阻滞剂等药物制剂，已证实对HF具有治疗效果。然而，这些治疗手段在发挥疗效的同时，也可能导致诸如低血压、心率过缓等不良反应。

中药复方强心饮（QXY）基于《伤寒论》中记载的真武汤改良，由附子、白术、淫羊藿、猪苓、补骨脂、白芍、川芎、茯苓、鹿角等九种中药组成。研究证实，QXY能够抑制氧化应激反应及心肌细胞凋亡，从而改善慢性心力衰竭患者的心功能。斑马鱼具有全身透明特性，便于观察心脏状况，且其遗传基因与人类高度相似。

因此，一篇名为“Qiangxinyin formula protects against isoproterenol-induced cardiac hypertrophy”的文章就基于斑马鱼模型对QXY的药物毒性、心功能影响、心肌肥大及心肌纤维化等方面进行了深入探讨。

图1 论文首页

QXY 改善了 ISO 诱导的斑马鱼心脏肥大、功能障碍和损伤

研究者利用心脏特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼Tg（cmlc2：GFP）胚胎，构建了由异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌肥大模型（图2A）。结果显示，在600µg/ml浓度以下，QXY对斑马鱼胚胎的毒性较低（图2B）。研究者将受精后24小时的Tg斑马鱼胚胎分为对照组、模型组以及模型加QXY干预组，并以普萘洛尔作为阳性对照。在倒置荧光显微镜下观察心脏形态，发现ISO处理组心输出量、心搏量、EF、SVED、SVES、∆S、VVED和VVES显著增加，但心率与FS无显著变化（图2C、D）。

经不同浓度的QXY提取物（100、200和600μg/ml）干预后，上述指标均呈现浓度依赖性降低。此外，研究检测了心脏损伤标志物c型利钠肽（cnp）、肌酸激酶MB（ckmb）和心肌肌钙蛋白t2（ctnt2）的基因表达水平。结果显示，ISO处理后，这些标志物的mRNA表达水平升高；而QXY干预后，显著降低了这些mRNA的表达水平（图2E）。据此，结果表明QXY提取物能够有效预防ISO诱导的斑马鱼心功能障碍与损伤。

图2 QXY对ISO诱导的斑马鱼心肌肥厚、功能障碍和损伤的保护作用

QXY抗异源性斑马鱼心肌肥厚和功能障碍主要活性成分的鉴定

在生物体内，糖苷ICA和QUE经过水解作用，分别生成果舷素（ICT）和槲皮素（QCT）。随后，研究者采用ISO诱导的斑马鱼心肌肥大模型，对八种化合物以及ICT和QCT的心脏保护功能进行了检测（图3、4、5）。

图3 PRN对ISO诱导的斑马鱼心肌肥厚和功能障碍的保护作用

结果显示，PRN和KMP能够显著降低ISO诱导的斑马鱼心脏肥大所导致的心输出量、每搏输出量、EF值、SVED、SVES、ΔS、VVED和VVES（图3、4）。

图4 KMP对ISO诱导的斑马鱼心肌肥厚和功能障碍的保护作用

值得注意的是，尽管ICA对ISO诱导的心肌肥大无显著影响，但其代谢产物ICT却显著降低了ISO诱导的心输出量、心搏出量、EF值、ΔS和VVES的升高，且对斑马鱼表现出较低的毒性（图5）。

图5 ICT对ISO诱导的斑马鱼心肌肥厚和功能障碍的保护作用

综合分析，PRN、KMP和ICA可能是QXY提取物中预防心脏损伤的有效活性成分。

QXY抑制H9C2心肌细胞钙内流和线粒体功能障碍

研究采用RNA-seq技术对斑马鱼进行转录组学分析探究了QXY的潜在药理学靶点。结果显示，约91.80%的测序序列与基因组汇编GRCz11中的注释基因匹配，共检测到25,619个基因。在QXY处理组与对照组之间，共鉴定出89个差异表达基因（DEGs），其中43个基因表达上调，46个基因表达下调。通过火山图对DEGs进行可视化，并进一步进行GO富集分析（图6A）。结果表明，QXY可能影响Ca2+相关的信号传导及蛋白质。

为探究QXY对H9C2心肌细胞内Ca2+内流的影响，研究采用ISO作为β-肾上腺素受体的特异性激活剂，通过L型钙通道触发Ca2+内流，并以硝苯地平（NIF）作为L型钙通道阻滞剂的阳性对照。结果显示，ISO可引发H9C2细胞内Ca2+升高，而5μg/ml QXY处理显著抑制了ISO诱导的细胞内Ca2+升高（图6B）。细胞内钙过载，由钙内流引起，可导致线粒体功能受损，进而引发心肌细胞损伤，表现为细胞内ROS积累、脂质过氧化及ATP减少。

研究还进一步通过JC-1染色法探究了QXY对细胞功能障碍的影响。结果显示，ISO破坏了线粒体膜电位，而与QXY共处理后，线粒体膜电位的破坏程度减轻（图6C、D）。QXY（5μg/ml）显著降低了细胞内MDA含量（图6E），并有效防止ISO处理的心肌细胞内ATP的减少（图6F）。综上所述，QXY能够抑制钙内流及线粒体功能障碍。

图6 QXY对ISO诱导的H9C2细胞钙内流和线粒体功能障碍的保护作用

QXY 抑制 ISO 诱导的肥大和细胞骨架重组

心脏肥厚的主要特征表现为心肌细胞的肥大及其细胞骨架的重组。结果显示，ISO处理显著增加了H9C2心肌细胞的细胞骨架面积及蛋白质浓度，而QXY的干预则显著降低了这些指标（图7A）。SMAD2家族成员及RhoA/Rho激酶（ROCK）信号通路在细胞肥大和细胞骨架重组过程中发挥重要作用。与单独ISO处理组相比，QXY与ISO共处理组中SMAD2的磷酸化水平显著提高。在各处理组中，心肌纤维化标志物α-SMA和波形蛋白的表达水平未出现显著变化（图7B）。此外，QXY与ISO共处理增加了肌球蛋白磷酸酶亚基1（MYPT1）的磷酸化，同时降低了肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化水平。然而，QXY并未影响ISO对ROCK1的还原作用及RhoA蛋白的表达量（图7C）。据此，QXY至少部分通过调节SMAD2和ROCK信号通路，显著抑制了心肌细胞的肥大及细胞骨架重组。

图7 QXY对ISO诱导的H9C2细胞细胞骨架重组和肥大的保护作用及机制

结论

该研究结果为QXY在心力衰竭治疗中的临床应用提供了科学依据，且有助于QXY的质量监控与后续药物研发。

参考文献：

Zhou ZY, Ma J, Zhao WR, Shi WT, Zhang J, Hu YY, Yue MY, Zhou WL, Yan H, Tang JY, Wang Y. Qiangxinyin formula protects against isoproterenol-induced cardiac hypertrophy. Phytomedicine. 2024 Jul 25;130:155717. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155717