导读

儿童炎症综合征包括川崎病（KD）、儿童多系统炎症综合征（MIS-C）、病毒感染和细菌感染等，由于具有重叠的临床表现、非特异性症状和发育年龄相关的交流障碍等，这类疾病的鉴别诊断往往很复杂，阻碍了有效的临床干预。目前，儿童炎症综合征的鉴别诊断通常依赖于体征和症状的临床评估以及广泛的实验室检查结果，但用于诊断的血清学检查和抗原生物标志物缺乏特异性。

近期的研究探索了使用全血转录组分析来评估疾病严重程度并区分炎症状况，发现其无法提供关于实体器官组织中炎症相关的细胞损伤或死亡程度的信息。相比之下，血浆中的游离核酸（包括cfDNA和cfRNA）由来自血液和实体组织的死亡或凋亡细胞释放，是评估炎症的潜在分析靶标，但cfRNA在儿童炎症综合征鉴别诊断中的潜力仍未得到充分探索。

美国康奈尔大学、加利福尼亚大学等机构的科研团队合作在PNAS杂志发表了题为“Plasma cell-free RNA signatures of inflammatory syndromes in children”的文章，探索了血浆中cfRNA在鉴别诊断和表征儿童炎症综合征方面的作用。研究团队对370例患有多种炎症的儿科患者血浆样本中的cfRNA进行分析，并利用cfRNA图谱开发了机器学习模型，可有效区分两种临床表现重叠的疾病（MIS-C和KD）；进一步扩展该方法并构建了一个多类别诊断分类器，准确率为80%。此外，cfRNA分析还能量化特定组织和器官的损伤。总之，该研究证明cfRNA可用于鉴别诊断及表征各种儿童炎症综合征。

文章发表在PNAS

主要研究内容

研究团队从美国四家医院收集并分析了370例患有炎症和感染性疾病患儿的血浆样本，包括诊断为KD、MIS-C、病毒感染、细菌感染的患儿，以及作为对照的其他住院患儿和健康儿童。研究人员详细记录了每位患者的年龄、性别、种族、严重程度和炎症状态，所有患者样本均在疾病急性期住院后4天内采集。

研究团队通过RNA-seq量化了每个样本中cfRNA的基因和起源细胞类型，平均每个样本测序了2,070万个reads。

图1. 样本信息概述

01 疾病的cfRNA特征

研究团队首先分析了在各种炎症情况下常见的血浆中cfRNA特征变化，通过在健康对照组和每个疾病组之间进行两两差异基因丰度分析，确定了所有差异丰富基因（DAGs）。其中，健康对照组与其他住院患者对照组之间的DAG数量最少，与KD患者之间的DAG数量最多。

研究团队进一步对上述DAG进行分析发现了大量的共享基因，其中最主要的是组蛋白编码基因，其在所有疾病组中都升高，这表明组蛋白转录物的增加是炎症的普遍指标。此外，共享DAG的通路富集分析显示，与炎症相关的中性粒细胞和细胞复制转录物通路显著富集。这些发现表明疾病组之间存在共同的炎症特征，并强调了组间比较以开发疾病特异性生物标志物的必要性。

图2. 不同炎症综合征之间共享的cfRNA特征

02 基于cfRNA可以区分MIS-C和KD

KD和MIS-C有许多共同的临床特征，如高度炎症性、表现为内皮功能障碍，以及皮疹、发热等多个重叠的症状，目前缺少能够将其准确区分的分子检测方法。为此，研究团队评估了cfRNA可否区分上述两种严重的儿童炎症综合征，将KD和MIS-C样本分为训练、验证和测试集，使用训练数据进行特征选择和训练机器学习模型，使用验证集来选择最终模型，最后使用测试集评估最终模型的性能。

研究团队确定了KD和MIS-C之间存在1,242个DAG，经筛选后获得132个DAG用于模型输入，并基于此训练了14个机器学习分类模型，其中正则化广义线性模型（GLMNET）显示出最高的验证集AUC，被选为最终模型。接下来，研究团队使用测试集对该模型性能进行评估，发现其可有效区分KD和MIS-C，AUC为0.98。

图3. 基于cfRNA特征区分KD和MIS-C

研究团队探究了cfRNA能否用于更具挑战性的多疾病分类，利用随机森林（RF）多类算法将一对一模型的输出结果相结合，并针对每个样本组训练了其各自的GLMNET一对一模型。结果显示，每个模型都表现出较高的分类准确率。进一步，研究团队使用上述一对一模型的分类评分训练了一个多类别RF分类器（共包含109个基因），在训练集和测试集上分别达到了100%和80%的分类准确率。这些结果表明，基于cfRNA能够对多种儿童炎性疾病进行分类和鉴别。

图4. 使用cfRNA对儿科疾病进行多类分类。

03 基于cfRNA表征疾病

除疾病分类，研究团队还分析了cfRNA能否表征疾病特征。先前研究表明，量化cfRNA细胞来源类型（CTO）是评估细胞、组织和器官特异性损伤的一种可行无创方法。在此，研究团队使用BayesPrism和Tabula Sapiens人类细胞图谱作为参考，对cfRNA的起源细胞类型进行反卷积，将CTO估计值与已知的生物标志物和其他特定器官损伤或功能障碍指标进行比较。

首先比较了肝细胞和肝内胆管细胞对血浆中cfDNA的贡献与丙氨酸转氨酶测量值（ALT），与ALT正常患者相比，高ALT患者肝细胞和肝内胆管细胞中cfRNA水平显著升高。在心功能异常组中，心肌细胞和周细胞的cfRNA水平升高，可能表明心肌细胞损伤或死亡增加。有趣的是，该组患者还表现出肾上皮细胞、肝内胆管细胞、I型肺泡细胞以及支气管上皮细胞的cfRNA水平升高，表明其他终末器官损伤与心功能受损相关。

为评估肺功能和损伤，研究团队重点分析了健康个体和COVID-19病毒感染患者的样本，并根据疾病严重程度对COVID- 19样本进行了详细分层。结果显示，与健康个体相比，中度COVID-19病例中Club细胞和I型肺细胞的cfRNA水平升高，严重病例的cfRNA水平升高更大。此外，通过cfRNA还能区分COVID-19感染、SARS-CoV-2感染和其他病毒病原体感染 。最后，基于四个真实患者病例，研究团队证明了cfRNA分析作为临床决策支持工具的可行性和可靠性。

图5. cfRNA特征分析可作为临床决策支持工具

结 语

综上所述，研究团队通过RNA-seq对血浆中的cfRNA进行分析，比较了儿童相关四种不同炎症和/或感染综合症的宿主免疫及细胞损伤反应，并构建了一个仅使用cfRNA的多类别诊断分类器来更好地区分、诊断和表征儿童炎症综合征。此外，该研究还发现cfRNA分析能够量化多器官系统的损伤程度，将其与组织损伤标志物相关联，能够区分不同的病毒感染。

论文原文：

Loy CJ, Servellita V, Sotomayor-Gonzalez A, et al., Plasma cell-free RNA signatures of inflammatory syndromes in children. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Sep 10;121(37):e2403897121. doi: 10.1073/pnas.2403897121.