糖尿病(DM)是以高血糖为特征的一种慢性代谢性疾病。近年来，糖尿病的发病率迅速攀升。由于糖尿病并发症复杂、严重，已成为导致糖尿病患者死亡的主要原因之一，严重威胁着世界的健康和社会经济。其中，糖尿病发病率还与不育症密切相关。越来越多的育龄期青年，甚至儿童，被诊断为2型糖尿病。

此外，越来越多的证据表明，糖尿病高血糖可广泛损害男性生殖系统，并伴有严重的睾丸组织学损害，包括输精管形态破坏和精子生成障碍，血清性激素下降，睾丸中氧化应激和凋亡的增加。然而，糖尿病导致男性生殖损害的潜在机制仍不完全清楚，目前尚无有效的治疗策略或药物。

目前，中药有效候选药物的筛选已引起越来越多的关注。其中淫羊藿苷(Icariin, ICA)是淫羊藿的主要活性成分，传统上被用于治疗勃起功能障碍。有研究指出，适量的ICA可通过提高卵泡刺激激素受体(FSHR)的水平，并通过上调类固醇急性调节蛋白(StAR)和外周型苯二氮卓受体(PBR)的表达来增加睾酮分泌，从而促进精子发生。

此外，Nan等人发现ICA可刺激支持细胞增殖，在调控精母细胞干细胞的自我更新和分化中发挥重要作用。ICA还可通过调节下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴改善男性生殖功能。

最近的研究也表明，ICA在其他系统中也有抗凋亡作用。有报道称ICA降低在心肌细胞的氧化应激；Qiao等人发现在治疗前ICA能通过抑制线粒体依赖的凋亡通路来减轻顺铂诱导的肾毒性。Wang等发现ICA可增强神经元活力，减少神经元死亡。Zhao等证实，ICA可通过特异性靶向Bax抑制age诱导的PC12细胞损伤，进而调控线粒体凋亡。这些研究表明，ICA的抗凋亡作用与经典线粒体凋亡途径密切相关。

因此，有理由推测线粒体凋亡途径可能参与了ICA对男性生殖系统的保护作用。然而，ICA对糖尿病大鼠雄性生殖功能障碍的影响及其机制尚不清楚。本研究通过建立高脂饮食(HFD)和链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，与二甲双胍比较，评价ICA对DM诱导的睾丸功能障碍的保护作用，旨在确定ICA对糖尿病大鼠睾丸细胞增殖和凋亡的影响。

1、ICA 改善了糖尿病大鼠的糖尿病相关参数

根据DM诊断标准成功地建立了T2DM大鼠模型。糖尿病大鼠的体重显著减轻，FBG、FINS和胰岛素抵抗指数（IRI）增加（表2）。为测试ICA的作用，检测ICA治疗糖尿病大鼠的上述参数。ICA 处理明显减少了 FBG 和 IRI，但对体重和 FINS 没有影响。作为管理高血糖的一线药物，二甲双胍作为比较组来评估 ICA 的效率。二甲双胍组增加了体重和 FINS， 并减少了FBG 和 IRI 。激素分析结果表明，T2DM组睾酮、LH和FSH的血清水平明显低于对照组；与 T2DM 组相比，二甲双胍和 ICA 用药组都恢复了性激素水平 （图1）。

2、ICA缓解糖尿病大鼠睾丸功能障碍

先前研究已证实DM和男性生殖功能障碍之间的因果关系。为了确定ICA对男性生殖功能的保护作用，我们首先检测了睾丸重量、附睾重量、精子数量和精子活力。与T2DM组相比，二甲双胍组和ICA组的四个参数均有明显的恢复，但ICA组精子数量的增加不如二甲双胍组(表3)。

接着进一步检查组织学结构。T2DM组输精小管严重萎缩至薄壁，输精小管截面积明显减少(图2A、B)。在异常的精原上皮内(图2A)，精原细胞、初级精母细胞和支持细胞的数量显著减少(图2C)，腔内可见少量精子(图2A)。而在二甲双胍和ICA组中，雄性糖尿病大鼠的组织学缺陷得到明显修复(图2)，特别是精原细胞、原发母细胞和支持细胞的数量(图2C)。

3、ICA上调增殖PCNA的表达

此外，我们还研究了增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的分布和表达，该抗原在细胞存活和死亡的平衡中起着至关重要的作用。结果显示，PCNA染色在几乎所有的生精细胞和支持细胞中都能检测到，PCNA染色最强的区域是在精小管的周长区域，这里是精母细胞、初级精母细胞和支持细胞的主要所在(图3A)。T2DM组PCNA阳性细胞数(图3B)和PCNA mRNA表达量(图3C)分别明显减少和下调。而ICA处理后，PCNA信号和PCNA阳性细胞明显增多(图3A和B)。Pcna的mRNA表达也明显上调(图3C)。与ICA相比，二甲双胍处理显示出类似效果(图3)。

另外，qPCR结果表明与对照组相比，2型糖尿病组的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)的mRNA表达水平明显下调,而二甲双胍和ICA治疗都部分恢复了糖尿病大鼠睾丸中GPx和SOD的mRNA表达水平(图4)。

4、ICA激活SIRT1 - HIF - 1α轴

越来越多研究表明，研究最多的乙酰化酶之一，SIRT1，在精子发生和男性生殖功能中发挥着重要作用。SIRT1与胰岛素抵抗之间有明显的相关性。此外，SIRT1可以直接去乙酰化并稳定HIF-1α， HIF-1α是一种缺氧激活的转录调控因子，可以调控缺氧应答因子的转录反应，从而保护睾丸中精原细胞免受凋亡。这些研究提示SIRT1-HIF-1α轴在修复DM诱导的男性生殖功能障碍中具有重要作用。

因此，本研究进一步检测SIRT1-HIF-1α轴的活性。在T2DM组中，SIRT1阳性和HIF-1α阳性细胞的数量均减少(图5A、C)。qRT-PCR和western blotting分析显示，Sirt1和Hif-1α均下调(图5B, D和E)。相比之下，ICA或二甲双胍可明显逆转这些情况，不仅增强了SIRT1和HIF-1α的信号(图5A和C)，而且上调了SIRT1和HIF-1α的表达(图5B, D和E)。

5、ICA减轻糖尿病大鼠线粒体凋亡信号

生殖细胞和生殖系统的正常发育高度依赖于BCL-2家族蛋白对线粒体凋亡的调控平衡。已有研究证实ICA抗凋亡作用与Bcl-2信号通路密切相关。因此，本研究还进行了TUNEL实验，鉴定了线粒体凋亡通路相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达情况(图6)。与对照组相比，T2DM组精小管中凋亡细胞数量明显增加，凋亡信号主要集中在周界区域(图6A、B)。Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA表达分别显著下调和上调(图6C)。

相比之下，ICA组和二甲双胍组凋亡细胞数量明显减少(图6A和B)， Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达分别显著上调和下调，尤其是ICA组明显下调(图6C)。

总的来说，本研究揭示了ICA可能通过增强细胞增殖和抑制固有线粒体依赖的凋亡信号来预防DM诱导的大鼠睾丸功能障碍(图7)。本研究结果表明，ICA能有效减轻DM诱导的男性生殖功能障碍和精子发生缺陷。ICA可能通过增加精原细胞、原代精母细胞和支持细胞的增殖和抑制线粒体依赖性凋亡途径来改善DM诱导的精子发生缺陷。本研究结果表明，ICA可能是一种潜在的保护和治疗SM诱导的睾丸损伤的新型治疗药物。

原文来源：

He et al.Icariin improves testicular dysfunction via enhancing proliferation and inhibiting mitochondria-dependent apoptosis pathway in high-fat diet and streptozotocin-induced diabetic rats. Reproductive Biology and Endocrinology (2021) 19:168.https://doi.org/10.1186/s12958-021-00851-9