前言

TLRs是一种先天免疫受体，直接或间接负责检测病原体相关分子模式（PAMP），并通过激活先天和适应性免疫途径对其作出反应。天然存在和合成的TLR激动剂可以利用这些内源性免疫信号通路来增强和调节疫苗反应，从而使其成为优良的疫苗佐剂。每种TLR都有自己的特定组织定位和下游基因信号通路，TLR激动剂可以与其他TLR或替代佐剂组合，以产生具有协同或调节作用的组合佐剂，这为研究人员提供了精确定制具有特定免疫效果的佐剂的机会。而决定何时用或不用TLR激动剂作为疫苗佐剂，有许多重要的考量因素。

考量因素1：疾病机制和保护的相关性

选择合适的TLR佐剂的第一步是了解疾病类型/作用模式和保护的相关性。例如，在传染病（如冠状病毒）的情况下，免疫反应的水平和类型很重要，不正确的疫苗免疫反应不仅不能保护个人免受疾病的侵害，而且可能导致疾病的进展，这一过程被称为疫苗增强疾病。

研究表明，当针对严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARS-CoV）的重组刺突蛋白或灭活全病毒疫苗与Th2偏向性明矾佐剂搭配时，这与病毒攻击后肺部嗜酸性粒细胞免疫病理学增加有关。而当用Delta inulin (Advax™)加TLR9佐剂（CpG）配制疫苗抗原时，这种疾病增强效果得到了改善。此外，研究表明，促进CTL活性的Th1型免疫是对抗肿瘤最有效的免疫反应，而癌症的疾病进展与Th2免疫的偏斜有关。因此，针对TLR的佐剂，如TLR3、4、7、8或9，可诱导IRF7和IRF3激活，导致1型干扰素反应，可能对癌症疫苗制剂有利。在其他疾病中，如寄生虫，Th2偏向性免疫反应更能减少疾病负担，而Th1反应可导致疾病增强。

免疫反应的程度和持续时间也可能因疾病而异。例如，对于新冠肺炎，恢复期血清中和抗体滴度≥60被归类为保护性，而对于日本人，脑炎病毒中和抗体滴度≥10被视为完全保护性。对于保护所需抗体水平较高的应用，B细胞上的靶向TLR可能是提高抗体产生的有效策略。

考量因素2：给药途径

给药途径是一个重要的免疫参数，可以影响疫苗免疫反应。除了传统的疫苗给药途径，如皮内、皮下和肌肉内，其他感兴趣的给药方式包括气雾剂和鼻内给药，因为它们能够产生粘膜免疫。粘膜免疫在预防肠道、呼吸系统和生殖道感染方面尤为重要。粘膜免疫可以产生分泌性IgA抗体和组织驻留的粘膜T细胞，为病原体入侵提供第一道防线。

TLRs在全身不同组织中差异表达，这可以影响诱导的免疫效果。如果组织部位的TLR丰度较低，可能导致次优免疫反应。研究证明，免疫途径对基于TLR7和TLR8的利什曼原虫主要疫苗的疗效有重大影响，保护性免疫仅在皮下接种后产生，而不是在肌肉内接种。另一项研究表明，TLR4和TLR7/8佐剂疫苗根据给药途径在小型猪中产生不同的免疫结果。当TLR4激动剂（GLA-AF）和TLR7/8激动剂（雷喹莫特，R848）皮内联合给药时，GLA-AF增强了对R848佐剂的免疫反应；但当鼻内联合给药时，GLA-AF消除了R848的佐剂活性。这些结果反映了不同组织区室之间固有感知群体和TLR表达模式的差异。

考量因素3：疫苗抗原特性

当将佐剂与疫苗抗原结合时，重要的是要了解抗原是否具有免疫惰性，或者是否已经含有固有的佐剂特性。例如，许多灭活的病毒抗原含有污染性DNA或RNA，其分别提供TLR9或TLR7的刺激，提供内在的佐剂活性。在其他情况下，佐剂被有意嵌入疫苗抗原中，以增强免疫原性。胺修饰的R848通过巯基交联剂结合到病毒A颗粒上，增强了TLR7/8佐剂活性的潜力，使抗流感IgG水平增加十倍。另一项研究中，研究人员制备了与Pam2Cys-SK4或Pam3Cys-SK4（TLR2激动剂）融合的全长ESAT6蛋白，产生协同作用发生显著的局部CD4+T细胞反应。此外，四种高度保守的A组链球菌（GAS）抗原与成纤维细胞刺激性脂肽-1（TLR2激动剂）偶联时，可导致IgG抗体增加。

考量因素4：佐剂配方

佐剂的配方和呈现方式会对其整体安全性和功能产生重大影响。由TLR7激动剂和结合SARS-CoV-2抗原的甘露糖组成的共聚物引发了强大的细胞和体液免疫反应，即使在老年小鼠中也是如此。 甘露糖成分通过其甘露糖结合受体促进APC对抗原和TLR7激动剂的内吞作用。该策略允许有效递送至感兴趣的靶向免疫细胞，因此仅需要较低剂量的抗原和佐剂。此外，在病毒样颗粒上高密度展示TLR5激动剂增强了佐剂的免疫原性和安全性，同时降低了系统性IL-6释放引起的毒性。而TLR7/8激动剂在超支化聚合物中的高密度呈递降低了脱靶毒性和快速全身清除，同时增强了体液反应。

除了影响归巢到特定组织区外，疫苗抗原/佐剂复合物的局部持续时间可能在形成细胞和体液免疫中发挥关键作用。例如，TLR7在明矾上的吸附产生了储库效应，允许TLR激动剂的缓慢控制释放。最近，有研究配制了聚合物纳米颗粒水凝胶，使TLR7/8配体和血凝素蛋白能够缓慢释放，这导致小鼠对单次注射的抗体滴度增加。

另一种制剂策略是将TLR佐剂直接偶联到抗原上，这促进了佐剂和抗原对相同APC的刺激。然而，研究结果喜忧参半。有研究设计了电荷修饰的肽TLR7/8偶联物，其自组装成纳米颗粒，从而增强CD8+T细胞的免疫原性和肿瘤清除率。然而，在其他研究中，TLR5配体与抗原的共表达导致免疫原性降低。而在体外将TLR2配体与乙肝病毒核心蛋白的合成长肽偶联物导致单核细胞衍生和原代DC亚群的交叉呈递效率较低。

近年来的新疫苗技术包括基于mRNA、DNA和病毒载体的疫苗。其中一些新疫苗具有固有的佐剂特性。TriMix是一种基于mRNA的佐剂，由编码共刺激分子CD70、CD40L和TLR4激活分子的mRNA分子组成。在癌症疫苗研究中，TriMix佐剂已被证明可增加DC成熟和CTL反应。新冠肺炎腺病毒载体疫苗也已被证明具有自佐剂特性，并激活TLR9，导致I型IFN分泌。

考量因素5：不同年龄组TLR佐剂作用的变异性

TLR的表达依赖于年龄和组织。在新生儿中，TLR被证明是下调的，而在老年人群中，TLRs变得失调。TLR2/6激动剂酵母多糖和TLR2激动剂β-葡聚糖在脐血单核细胞中诱导细胞因子反应。有研究探索了许多含有Poly I:C、MPLA或R848的TLR激动剂组合，以评估它们是否能诱导强大的Th1免疫反应。出乎意料的是，添加TLR9激动剂CpG寡核苷酸显著降低了脐血IFN-γ水平，添加TLR2激动剂诱导了高IL-13，这是一种Th2极化细胞因子。这些研究的局限性在于，它们是在人类脐带血上进行的离体研究，在新生儿动物模型和婴儿中进行免疫研究仍然很重要。与年轻患者相比，TLRs的表达和活性在老年患者中失调。克服老年人免疫衰老的最有效策略可能是同时触发多个TLR。

参考文献：

1.Toll-like receptor (TLR) agonists as a driving force behind next-generation vaccine adjuvants and cancer therapeutics. Curr Opin Chem Biol.2022 Oct;70:102172