基因编辑“魔术师”让小鼠听力重生，持续超1.5年！

OTOF基因位于人类第8号染色体上，编码一种名为otoferlin的蛋白。Otoferlin是一种膜结合钙离子结合蛋白，主要在内耳的内毛细胞（IHCs）的突触小体中发挥作用，负责调节突触囊泡的钙依赖性释放，从而在听觉信号的传递中起到关键作用。在正常听觉过程中，声音信号通过耳蜗中的内毛细胞转化为神经信号，这些信号通过听神经传递到大脑。然而，当OTOferlin功能受损时，这一过程会受到显著影响。c.2485C>T，p.Q829X突变是一种常见的隐性突变，导致该基因编码的otoferlin蛋白产生提前终止的截短蛋白，丧失了其正常功能。这种突变的存在阻止了突触小体中囊泡的正常释放，最终导致神经信号的传递障碍，从而引发先天性重度听力损失。

在这项研究中，复旦大学舒易来研究团队展示了在携带与人类OTOF基因相同的突变（c.2482C>T，p.Q828X）的Otof小鼠模型中，使用由去氨酶 ABE7.10max 和 Cas9 变体 SpCas9-NG 组成的碱基编辑器（ABE），通过腺相关病毒包装并注射到小鼠内耳的圆窗膜中，成功纠正了致病突变，并未发现明显的脱靶效应。该治疗将88%的内毛细胞中的otoferlin蛋白水平恢复至接近正常，并将小鼠的听觉功能稳定恢复至接近野生型水平，持续超过1.5年，同时改善了内毛细胞的突触外排功能。作者还展示了一种针对流行的人类OTOF突变的腺嘌呤碱基编辑器在人源化小鼠中恢复了听力，达到与正常对照小鼠相当的水平。这表明，碱基编辑技术可能有效用于治疗遗传性耳聋。该研究以题为“A base editor for the long-term restoration of auditory function in mice with recessive profound deafness”的论文发表在最新一期《Nature biomedical engineering》。

遗传性耳聋是一种常见的感觉性障碍，主要由遗传因素引起。全球约有2600万人受先天性耳聋影响，其中约60%由遗传因素导致。听神经病谱系障碍（ANSD）是一种常染色体非综合征性听力损失，其特点是听觉信号传递出现问题，可能由于内毛细胞、突触、螺旋神经节神经元缺陷或听神经的脱髓鞘等引起。OTO基因是首个与ANSD相关的基因，负责41%至91%的ANSD病例，OTOF突变也导致2%至8%的先天性遗传性耳聋。c.2485C>T，p.Q829X是最常见的致病突变，导致严重的感音神经性听力损失。当前临床无有效药物治疗，尽管早期试验显示一定效果，但长期效果和安全性仍需验证。

为了研究OTOF p.Q829X突变在听力损失中的作用并探索治疗方法，作者利用CRISPR/Cas9技术构建了一个含有相同突变（Otof: c.2482C>T, p.Q828X）的鼠模型。免疫组化结果显示，正常小鼠的耳蜗内毛细胞中otoferlin蛋白正常表达，而Otof^Q828X/Q828X纯合小鼠则未见otoferlin表达。听觉测试表明，Otof^+/Q828X杂合小鼠的听力与野生型小鼠相当，而Otof^Q828X/Q828X小鼠则出现了完全的听力丧失，与患者的听力丧失表型一致。

在ABE治疗研究中，传统上使用融合WT SpCas9的腺嘌呤脱氨酶。然而，Otof^Q828X小鼠模型中的致病突变位于ABE的活性窗口内，但经典NGG PAM序列未找到。为解决此问题，作者选择了三种非经典PAM序列的SpCas9变体（SpCas9-NG、SpG和SpRY），并与TadA-8e脱氨酶结合，生成了NG-ABE8e、SpG-ABE8e和SpRY-ABE8e。使用这些ABE系统在Neuro2a（N2a）-Otof^Q828X细胞中进行编辑，结果显示纠正率分别为53.7%、48.8%和62.6%，但也观察到旁观者编辑现象。插入/缺失频率较低。由于ABE7.10max的活性窗口较窄，作者评估了其纠正效率，发现与ABE8e相似，但旁观者编辑显著减少。NG-ABE7.10max被选为后续实验的编辑器。因其大小超出AAV载体的包装容量，作者将其分为两部分并重新组装。分裂的NG-ABE7.10max在N2a-Otof^Q828X细胞中的纠正效率为30.1%，稍低于完整版本。最终，分裂的NG-ABE7.10max用于后续体内研究。

图1. 体外筛选OtofQ828X碱基编辑的最佳ABE

NG-ABE7.10max的N端和C端分别包装到AAV-PHP.eB载体中，用于转导毛细胞。作者将这两种AAV（各1.5 × 10^10 vg）混合注射到P1–3阶段的Otof^Q828X/Q828X小鼠内耳，通过圆窗膜进行注射。四周后，通过高通量测序（HTS）检测到的平均纠正效率为2.1%，与先前研究一致。为了更准确评估编辑效率，作者在注射后6个月收集耳蜗进行全片观察，并对毛细胞以外的组织进行精细解剖。提取基因组DNA后，测得编辑效率为13.8%，比新鲜耳蜗软组织中的2.1%高6.6倍。这表明，NG-ABE7.10max能够在体内非分裂细胞中实现高效、精确的编辑。

为评估NG-ABE7.10max的脱靶效应，作者使用GUIDE-seq技术对N2a-OtofQ828X细胞的基因组进行分析，发现12个潜在脱靶位点。通过Cas-OFFinder预测的18个潜在脱靶位点中，无显著A到G编辑现象。RNA脱靶分析显示，NG-ABE7.10max在转染后48小时观察到A到I编辑，但96小时后编辑水平降至背景水平，主要发生在UA基序。体内研究中，AAV_NG-ABE_m-sg治疗组与对照组相比，A到I转换位点未显著增加。这表明NG-ABE7.10max在体内具有较低的脱靶效应。

图2. NG-ABE对Otof^Q828X/Q828X小鼠致病性突变的修正

在8周龄Otof^Q828X/Q828X小鼠中，使用N端和C端otoferlin抗体评估了otoferlin表达，发现未有表达。将AAV_NG-ABE_m-sg注射到P1–3阶段的小鼠内耳后，约88.0±4.4%的IHCs中恢复了otoferlin表达。在耳蜗的基部、中部和顶端，otoferlin转导率分别为76.6±9.5%、88.6±3.8%和97.8±1.5%。还观察到对侧耳中也有otoferlin表达，可能因AAV进入脑脊液后转移到对侧耳。这表明AAV_NG-ABE_m-sg系统能有效恢复IHCs中的otoferlin表达。

图3. 双AAV碱基编辑器处理恢复了otoferlin在耳聋小鼠Otof^Q828X/Q828X中的表达

为了评估AAV_NG-ABE_m-sg系统的耳毒性，在Otof^Q828X/Q828X小鼠中注射AAV_NG-ABE_m-sg后，4周内听力显著恢复，ABR阈值提高约30–47 dB SPL，接近正常小鼠水平。注射后8周和12周，听力改善持续。行为评估显示，治疗组小鼠的声启动反应（ASR）和预刺激抑制（PPI）显著增强，听觉感知和声音处理能力提升。即使在听觉发育后注射，听力仍能显著恢复，ABR阈值降低约29–44 dB，显示该系统在Otof^Q828X/Q828X小鼠中有效恢复听力功能。

图4. 双AAV碱基编辑器治疗可恢复耳聋Otof^Q828X/Q828X小鼠的听觉和行为功能

在P1–3注射AAV_NG-ABE_m-sg的Otof^Q828X/Q828X小鼠中，听力在24周后与WT小鼠无显著差异，未治疗组则持续重度耳聋。治疗组在52周和60周后听力仍保持良好，60周后听力恢复到接近WT水平（约56–71 dB SPL），且这种效果持续超过一年。同样，治疗组对侧耳的听力也有所改善，尽管不及注射耳。ASR和PPI测试显示，治疗后60周小鼠的听觉反应和抑制能力明显优于未治疗组。耳蜗中otoferlin的表达在IHCs中良好维持，AAV_NG-ABE_m-sg系统的长期安全性良好，RNA和基因组DNA的脱靶效应未见显著增加。

图5. AAV_NG-ABE_m-sg治疗可恢复耳聋Otof^Q828X/Q828X小鼠的长期听觉功能

在P15的Otof^Q828X/Q828X小鼠中，IHC的带状突触数量显著减少，突触聚集在IHC内侧。注射AAV_NG-ABE_m-sg系统后，受救IHC的突触数量明显增加（基底部: 8.8 ± 0.2，顶端: 9.6 ± 0.2，n=105 IHCs），且突触聚集现象得到缓解。为了评估Otof^Q828X/Q828X小鼠IHC中Ca²⁺触发的突触囊泡胞吐作用是否恢复，研究在P16–18进行了全细胞膜片钳记录。结果显示，治疗组小鼠IHC的去极化诱导胞吐几乎恢复到WT水平（治疗组: 9.2 ± 1.4 fF，WT: 9.8 ± 1.6 fF），RRP（易释放池）和SRR（持续释放速率）也显著改善，分别达到WT水平。这些结果表明，体内碱基编辑能有效恢复OtofQ828X/Q828X小鼠的突触胞吐功能。

图6. AAV_NG-ABE_m-sg治疗可挽救耳聋Otof^Q828X/Q828X小鼠Ca²⁺触发的突触胞吐

同时研究筛选了针对人类OTOF p.Q829X位点的ABE治疗系统。使用NG-ABE7.10max，修复率达71.6%，非目标编辑较少。将该系统注射至人源化Otof^Q829X/Q829X小鼠内耳，4周后听力显著恢复，ABR阈值从>90 dB降至33.9 dB，接近WT小鼠水平。尽管检测到轻微的离靶效应，但安全性需在临床前进一步评估。

图7. 体外筛选人OTOF c.2485C>T . q829x最佳ABE及体内听力功能恢复

总而言之，本研究利用CAG启动子实现了碱基编辑，开发了一种具有临床价值的ABE治疗策略，为遗传性耳聋和其他疾病的治疗提供了新的前景。成功永久恢复了Otof^Q828X/Q828X和Otof^Q829X/Q829X小鼠的听力功能，为OTOF p.Q829X突变患者提供了潜在治疗方案。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01235-1